强抗原决定簇hafp542

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1、强抗原决定簇hAFP542：羊东晔李彩虹,蓝方,张扬清,卢放根,杨峥嵘,黄来强【摘要】目的:构建包含甲胎蛋白强抗原决定簇hAFP542-550、EGFP和GPI锚定蛋白GPC3三者组成的融合蛋白GPC3hAFP542-550EGFP表达质粒pGPC3EGFP,确定其定位表达在真核细胞膜上,以强化靶细胞的免疫原性。方法:①采用RTPCR方法从人胎盘组织总RNA中调取GPC3基因,化学合成基因片段KOZAKGP＋afp542-550,并从pEGFPN1质粒中扩增EGFP基因,三者嵌合构建融合蛋白的表达质粒pcDN

2、A3.1(+)/GP＋afp542-550EGFPGPCC（pGPC3EGFP）;②以Lipofectamine2000转染质粒pGPC3EGFP入肝癌细胞株HepG2（GPC3+AFP+）,转染后24h和48h引物GPF和EGFPrRTPCR及:ToconstructtherebinantplasmidofpGPC3EGFPcontaininghumanAFP542-550gene,EGFPgeneandGPC3genetoexpressfusionproteinGPC3hAFP542-550EGFPa

3、ndtodiscoveritslocalizationoncytoplasmicmembrane.METHODS:GPC3genetotalRNAofhumanplacentaltissuesbyRTPCR;Aftertheenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)geneplifiedfrompEGFPN1plasmidandthegenesegmentofKOZAKGP＋afp542-550icallysynthesized,therebinantplasmidpcDNA3.1(

4、+)/GP＋afp542-550EGFPGPCC(pGPC3EGFP)containingthreechimericgenesofstrongepitopehAFP542-550,GPIanchoredproteinGPC3andEGFPine2000.EGFPexpressionicroscopyafterpGPC3EGFPidtransfectionasapositivecontrol.Thefusionproteininbothmembraneproteinsandsolubleproteinsextract

5、edfromthetransfected293cells(GPC3-AFP-)onoclonalantibodyasprimaryantibody.RESULTS:TherebinantplasmidpGPC3EGFPers(GPFandEGFPr)butalsoby109、DH5α由深圳市基因与抗体治疗重点实验室保存。反转录系统试剂盒、pGEMT试剂盒（Promega公司）;pyrobest酶、LATaq酶和限制性内切酶EcoRI、XbaI、Ligationmix试剂盒（TaKaRa公司）;QIAGENplasmi

6、dminiKit（Qiagen公司）,质粒小提试剂盒和胶纯化回收试剂盒（Omega公司）;限制性内切酶KpnI、NheI、EcoRI、耐热磷酸酶、T4连接酶（Neine2000转染试剂盒,DMEM（高糖）培养基、2.5g/L胰蛋白酶+EDTA、链霉素和青霉素双抗、兔抗GFP多抗、Xgal和IPTG购自（Invitrogen公司）;小鼠抗人GPC3mAb（RDsystems公司）;山羊抗兔（小鼠）IgG重链和轻链辣根过氧化物酶底物（CalbiochemNovabiochem公司）;LumiGLOChemiluminesce

7、ntSubstrate显色液（KPL公司）;预染蛋白质MarkerSM0671（深圳晶美公司）;雀巢牌脱脂奶粉;PVDF膜（BioRad公司）;cocktailpletemini购自Roche公司,ProteoExtractNativeMembraneProteinExtractionKit购自Merck公司。RIPA蛋白裂解液［150mmol/LNaCl、50mmol/LTrisHCl(pH7.4)、100g/LTritonX100、10g/L脱氧胆酸、1g/LSDS和1mmol/LEDTA］。1.2方法1.2.1p

8、cDNA3.1(+)/KOZAKGP＋afp542-550EGFPGPCC（pGPC3EGFP）质粒构建所有引物和化学合成序列均由上海基康生物技术服务有限公司合成,构建所需引物序列和相关质粒见表1,表中带下划线的字母为酶切位点。表1pGPC3EGFP质粒构建中引物和相关质粒TRI