临床医学毕业论文强抗原决定簇hafp542-550在真核细胞膜定位表达研究.doc

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1、XX大学毕业论文强抗原决定簇hAFP542・550在真核细胞膜定位表达研究2014年6月25日强抗原决定簇hAFP542・550在真核细胞膜定位表达研究作者：羊东晔李彩虹，蓝方，张扬清，卢放根，杨峥喋，黄来强【摘要】FI的：构建包含甲胎蛋白强抗原决定簇hAFP542・550、EGFP和GPI锚定蛋白GPC3三者组成的融合蛋白GPC3hAFP542-550EGFP表达质粒pGPC3EGFP,确定其定位表达在真核细胞膜上，以强化靶细胞的免疫原性。方法：①采用RTPCR方法从人胎盘组织总RNA屮调取GPC3基因，化学

2、合成基因片段KOZAKGPCN+afp542-550,并从pEGFPN1质粒屮扩增EGFP基因，三者嵌合构建融合蛋白的表达质粒pcDNA3.1(+)/GPCN+afp542-550EGFPGPCC(pGPC3EGFP);②以Lipofectamine2000转染质粒pGPC3EGFP入肝癌细胞株HepG2(GPC3+AFP+),转染后24h和48h引物GPCNF和EGFPrRTPCR及Westernblot检测融合蛋白GPC3hAFP542-550EGFP表达；③对照质粒pEGFPN1和pGPC3EGFP转染H

3、epG2,荧光显微镜观察比较两种质粒EGFP蛋白表达的部位;pGPC3EGFP转染人胚肾HEK293细胞(GPC3・AFP・)，提取细胞膜蛋白和可溶蛋白Westernblot检测融合蛋白表达。结果：①成功构建pGPC3EGFP质粒;②融合蛋白可在HepG2小表达；③与pEGFPN1不同，融合蛋白主要在胞膜JL出现荧光反应，胞质内仅见散在零星荧光；转染后HEK293细胞的膜蛋口屮检测到融合蛋白表达，而可溶蛋白屮未检出。结论:pGPC3EGFP可以在真核细胞屮表达，表达的融合蛋白GPC3hAFP542-550EGF

4、P仍然定位表达在细胞膜，是一种新型GPI再锚定蛋白。【关键词】人AFP542-550,glypican3;增强绿色荧光蛋白EGFP;真核细胞；蛋白质工程[Abstract]AIM:ToconstructtherecombinantplasmidofpGPC3EGFPcontaininghumanAFP542-550gene,EGFPgeneandGPC3genetoexpressfusionproteinGPC3hAFP542-550EGFPandtodiscoveritslocalizationoncytop

5、lasmicmembrane.METHODS:GPC3genewasobtainedfromtotalRNAofhumanplacentaltissuesbyRTPCR;Aftertheenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)genewasamplifiedfrompEGFPN1plasmidandthegenesegmentofKOZAKGPCN+afp542-550waschemicallysynthesized,therecombinantplasmidpcDNA3.1(

6、+)/GPCN+afp542-550EGFPGPCC(pGPC3EGFP)containingthreechimericgenesofstrongepitopehAFP542-550,GPIanchoredproteinGPC3andEGFPwasconstructed.Thefusionprotein(GPC3hAFP542-550EGFP)wasdetectedonRNAandproteinlevelsat24hand48hafterpGPC3EGFPwastransfectedintoHcpG2(GPC3

7、+AFP+)vialipofcctaminc2000.EGFPexpressionwasobservedbyfluorescentmicroscopyafterpGPC3EGFPwastransfectedintoHepG2usingpEGFPN1plasmidtransfectionasapositivecontrol.Thefusionproteininbothmembraneproteinsandsolubleproteinsextractedfromthetransfected293cells(GPC3

8、-AFP-)wasdetectedbyWesternblotusingGPC3monoclonalantibodyasprimaryantibody.RESULTS:TherecombinantplasmidpGPC3EGFPwassuccessfullyconstructedthroughrestrictionendonucleasedigestionandsequencing;pG