真核细胞表达系统(自动保存)

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1、4000字。技术方法类（包括分析方法类）释文提纲：（1）定义及概述（不设标题）（2）技术或方法原理（及发展历史）（3）应用及注意事项意见：基本符合百科全书的要求。真核细胞表达系统（Eukaryoticexpressionsystem）运用基因工程技术手段，在体外将外源基因分子插入病毒、质粒等载体分子，形成新的遗传物质组合，并导入真核细胞中实现外源基因蛋白表达的技术系统。按照宿主细胞类型，真核细胞表达系统包括酵母表达系统、丝状真菌表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。真核细胞表达系统是重组蛋白表达的有利工具，在基础科学及医药领域发挥了重要作用

2、。技术或方法原理（及发展历史）酵母表达系统酵母是低等的单细胞真核模式生物，已完成基因组测序，遗传背景清晰，具有生长繁殖快，成本低，易于实现高密度培养和大规模发酵的优点。目前发展成熟的酵母表达系统主要包括酿酒酵母表达系统和毕赤酵母表达系统。酿酒酵母在食品工业领域的使用已有数千年历史，被美国FDA确认为安全性生物。1981年，Hitzeman等将成功将人干扰素基因导入酿酒酵母细胞，揭开了酿酒酵母表达系统的研究和应用历史，迄今已有多种外源蛋白在酿酒酵母中获得表达。然而酿酒酵母表达系统存在缺乏强启动子，质粒易丢失，分泌效率低，且富含高甘露糖型超糖基化等不足，导

3、致表达产物存在过度糖基化的局限性，而逐渐被巴斯德毕赤酵母等甲醇营养型酵母表达系统所取代。巴斯德毕赤酵母来源于野生型石油酵母NRRL-Y11430，为子囊菌类单倍体酵母，富含甲醇代谢必须的醇氧化酶、过氧化氢酶、二羟丙酮合成酶的过氧化物酶系，能在以甲醇为唯一碳源的简单培养基上快速生长，属于甲醇营养型酵母的一种。基因工程常用的毕赤酵母菌株主要包括GS115（Mut+His—）、X-33（Mut+His+）、KM71（MutsHis—）、SMD1168（his4pep4）等。目前毕赤酵母表达系统的启动子有醇氧化酶AOX1启动子(Ellisetal.,1985)

4、及三磷酸甘油醛脱氢酶GAP启动子，外源基因通过同源重组整合到酵母染色体基因组上,外源蛋白表达水平受甲醇或葡萄糖的严格调控。表达产物有胞内表达和胞外分泌两种方式，胞内表达适合于通常在胞浆中表达或不含二硫键的非糖基化蛋白，胞内表达载体有pPIC3、pPSC3k、pHIL-D1、pAO815等[5]。分泌型表达载体在酵母α因子信号肽的引导下，将成熟的蛋白质分泌到细胞外，分泌型表达载体有pPIC9K、pHIL-S1p、YAM7SP6、pGAPZa、pPICZα等。毕赤酵母表达系统具有操作简便、遗传稳定、表达量高、对目的蛋白质进行糖基化、二硫键形成等翻译后修饰功

5、能，使表达的重组蛋白具有同天然蛋白相似的生物学功能，在非糖活性蛋白生产上具有显著优势。昆虫细胞表达系统昆虫细胞具有与高等真核生物细胞相似的翻译后修饰、加工及转移蛋白质的能力。昆虫细胞表达系统主要利昆虫细胞、昆虫整体和杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能,如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等,使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白;其最高表达量可达500mg/L;可表达非常大的外源性基因(-200kD);具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力;对脊

6、椎动物安全。由于病毒多角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高,至今已有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。昆虫杆状病毒表达载体系统是一个利用杆状病毒作为外源基因的载体通过感染昆虫细胞或者昆虫幼虫来表达外源蛋白的系统。该系统自上世纪八十年代开发成功以来，在过去的二十年里得到了迅速的发展，已被证明为高效的真核表达系统之一[1]，目前在重组蛋白表达生产、工程疫苗和蛋白质组学研究等领域得到了越来越多的应用。昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统,它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中

7、表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式,其表达的蛋白水平高达1~500mgPL,但受到诸多因素的限制和影响,如培养基质量、供氧情况、保证对数生长等;此系统的主要缺点是外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下,而这时由于病毒感染,细胞开始死亡。解决办法是适当的启动子调控下的基因稳定转化。另一类新型的昆虫表达系统是建立在对果蝇等昆虫细胞进行稳定转化的基础上的,在稳定和表达效率方面有更为突出的优点。利用转座子转化昆虫细胞,目前已借助herm、hobo、mariger、piggyBac等转座子完成了对果蝇、伊蚊等双翅目昆虫细胞的稳定转化,然而其对鳞翅目昆虫却没

8、有效果[14]。此系统可用于大量制备有功能活性的目的蛋白,其表达水平高于哺乳动物表达系统,并且