强抗原决定簇hafp542-550在真核细胞膜定位表达研究

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1、强抗原决定簇hAFP542-550在真核细胞膜定位表达研究作者：羊东晔李彩虹,蓝方,张扬清,卢放根,杨峥嵘,黄来强【摘要】目的:构建包含甲胎蛋白强抗原决定簇hAFP542-550、EGFP和GPI锚定蛋白GPC3三者组成的融合蛋白GPC3hAFP542-550EGFP表达质粒pGPC3EGFP,确定其定位表达在真核细胞膜上,以强化靶细胞的免疫原性。方法:①采用RTPCR方法从人胎盘组织总RNA中调取GPC3基因,化学合成基因片段KOZAKGPCN＋afp542-550,并从pEGFPN1质粒中扩增EGFP基因,三

2、者嵌合构建融合蛋白的表达质粒pcDNA3.1(+)/GPCN＋afp542-550EGFPGPCC（pGPC3EGFP）;②以Lipofectamine2000转染质粒pGPC3EGFP入肝癌细胞株HepG2（GPC3+AFP+）,转染后24h和48h引物GPCNF和EGFPrRTPCR及Westernblot检测融合蛋白GPC3hAFP542-550EGFP表达;③对照质粒pEGFPN1和pGPC3EGFP转染HepG2,荧光显微镜观察比较两种质粒EGFP蛋白表达的部位;pGPC3EGFP转染人胚肾HE

3、K293细胞（GPC3-AFP-）,提取细胞膜蛋白和可溶蛋白Westernblot检测融合蛋白表达。结果:①成功构建pGPC3EGFP质粒;②融合蛋白可在HepG2中表达;③与pEGFPN1不同,融合蛋白主要在胞膜上出现荧光反应,胞质内仅见散在零星荧光;转染后HEK293细胞的膜蛋白中检测到融合蛋白表达,而可溶蛋白中未检出。结论:pGPC3EGFP可以在真核细胞中表达,表达的融合蛋白GPC3hAFP542-55014EGFP仍然定位表达在细胞膜,是一种新型GPI再锚定蛋白。【关键词】人AFP542-550,glypic

4、an3;增强绿色荧光蛋白EGFP;真核细胞;蛋白质工程［Abstract］AIM:ToconstructtherecombinantplasmidofpGPC3EGFPcontaininghumanAFP542-550gene,EGFPgeneandGPC3genetoexpressfusionproteinGPC3hAFP542-550EGFPandtodiscoveritslocalizationoncytoplasmicmembrane.METHODS:GPC3genewasobtainedfromtotalRNAo

5、fhumanplacentaltissuesbyRTPCR;Aftertheenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)genewasamplifiedfrompEGFPN1plasmidandthegenesegmentofKOZAKGPCN＋afp542-550waschemicallysynthesized,therecombinantplasmidpcDNA3.1(+)/GPCN＋afp542-550EGFPGPCC(pGPC3EGFP)containingthreechim

6、ericgenesofstrongepitopehAFP542-550,GPIanchoredproteinGPC3andEGFPwasconstructed.Thefusionprotein(GPC3hAFP542-550EGFP)wasdetectedonRNAandproteinlevelsat24hand48hafterpGPC3EGFPwastransfectedintoHepG2(GPC3+AFP+)vialipofectamine2000.EGFPexpressionwasobservedbyfluores

7、centmicroscopyafterpGPC3EGFPwastransfectedintoHepG2usingpEGFPN1plasmidtransfectionasapositivecontrol.Thefusionproteininboth14membraneproteinsandsolubleproteinsextractedfromthetransfected293cells(GPC3-AFP-)wasdetectedbyWesternblotusingGPC3monoclonalantibodyasprimary

8、antibody.RESULTS:TherecombinantplasmidpGPC3EGFPwassuccessfullyconstructedthroughrestrictionendonucleasedigestionandsequencing;pGPC