高糖诱导牛视网膜微血管周细胞foxo1a表达增加

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1、高糖诱导牛视网膜微血管周细胞FOXO1A表达增加【关键词】周细胞　葡萄糖　FOXO1A　蛋白表达　　Up-expressionofFOXO1AinbovineretinalmicrovascularpericytesinducedbyglucoseAbstractAIM:TostudytheexpressionofFOXO1Ainbovineretinalmicrovascularpericytesculturededium.METHODS:Primarybovineretinalmicrovascularpericyteseasuredinbovinereti

2、nalmicrovascularpericytestreatedmol/L),highglucose(30mmol/L)andH2O2(5μmol/L)inmediumcontaining20mL/LfetalbovineserumusingimmunocytochemistryandEM中，剪碎至糊状，过100μm滤网,然后翻转滤网，DMEM冲洗收集洗脱液。800r/min4℃离心5min。吸除DMEM,加入3倍体积625kU/LⅠ型胶原酶溶液，37℃孵育10min后终止，过88μｍ滤网,收集网下洗脱单细胞悬液。800r/min4℃离心5min后弃上清。取离心

3、后的底部组织加入含200mL/LFBS的DMEM，50mL/LCO237℃孵箱中培养,48h后更换培养液。每3～4d用细胞刮子将不需要的细胞刮除。待细胞近融合时用0.25g/L胰蛋白酶液消化传代，以1∶2接种在新的培养瓶内。传代后取第1代细胞以5×105个细胞/孔接种于预置有用L-多聚赖氨酸包被的盖玻片的24孔培养板内,含200mL/LFBS的DMEM培养近80%时，40mL/L多聚甲醛固定细胞30min,α平滑肌肌动蛋白抗体免疫荧光法及vonA)mAb,阴性对照组加0.01mol/LpH值7.2PBS,4℃过夜;PBS冲洗后，滴加二抗为羊抗兔1∶100IgG-

4、异硫氰酸荧光黄(FITC)室温避光孵育30min;PBS冲洗后荧光显微镜观察,细胞发出绿色荧光为阳性。兔抗鼠vonEM培养基中培养72h后，40g/L多聚甲醛固定细胞30min，各组周细胞爬片充分水化,PBS冲洗，2mL/LTritonX-100作用10min，PBS冲洗；30mL/LH2O2灭活内源性过氧化物酶活性10min后PBS冲洗。正常羊血清封闭30min，倾去多余血清,滴加一抗为1∶200兔抗FOXO1A多克隆抗体，阴性对照组加0.01mol/LpH值7.2的PBS，未加一抗，4℃过夜，PBS冲洗，滴加1∶1000生物素化的羊抗兔二抗30min，PBS

5、冲洗，滴加辣根过氧化酶结合的卵白素30min，PBS冲洗后，DAB显色。常规酒精脱水，二甲苯透明后封片。1.2.3EM培养液中培养24,48,72h，以便于下步实验。周细胞孵育规定时间后，用冰PBS冲洗后，细胞培养瓶内加入适量细胞裂解液(20mmol/LTris-HCl,pH7.5;150mmol/LNaCl;10ml/LTritonX-100;1mmol/LEDTA;1mmol/LEGTA;1mmol/LPMSF;250mmol/LNa4P2O7;1mmol/LNaF;1mmol/LNa3VO4)收集，180A荧光染色的阳性,阳性率达95%以上(图1C)。vo

6、nEM培养液中培养24，48，72h。AFITC×400图2牛视网膜微血管周细胞FOXO1A免疫细胞化学分析×200A：低糖组周细胞弱阳性；B和C：高糖组和过氧化氢组阳性图3牛视网膜微血管周细胞FOXO1A和phospho-FOXO1A蛋白免疫印迹分析N，D1，D2，D3，M：对照组、高糖条件下培养24，48，72h和甘露醇组，β-actin为内参照。上图免疫印迹法分析不同培养基周细胞FOXO1A蛋白水平，条带的分子量为70kDa；下图免疫印迹法分析不同培养基周细胞phospho-FOXO1A蛋白水平，条带的分子量为82kDa。aP＜0.05vs对照组3讨论糖尿

7、病视网膜病变主要病理改变是视网膜微血管病变。周细胞丧失和微动脉瘤的形成是早期糖尿病视网膜改变的标志[4]。周细胞在视网膜的密度最高，引起周细胞丧失的因素很多，慢性高血糖是主要的因素，导致血管壁减弱产生微动脉瘤[5，6]。视网膜微动脉瘤超微结构分析揭示周细胞的缺失，证明血管的完整性丧失由于周细胞的丧失引起，使血管容易形成微动脉瘤和进展性的血管闭塞导致血管渗透性增加、黄斑水肿或新的增殖的形成和新生血管[7].进一步研究表明由于周细胞丧失与视网膜病变新生血管的发生以及毛细血管的发育和血管生长的停止有关，说明周细胞对毛细血管的生长起抑制性的影响[8]。但是有关周细胞丧失

8、的详细机制仍然不清楚。周