高糖对体外培养兔视网膜mailer细胞表达血管内皮生长因子影响

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1、高糖对体外培养兔视网膜Mailer细胞表达血管内皮生长因子影响朱茂丽　刘　瑶　陈平圣　艾　静[摘要]目的探讨高糖对体外培养兔视网膜Mailer细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法体外培养兔视网膜Mailer细胞，采用免疫细胞化学方法半定量检测不同浓度葡萄糖对视网膜MUller细胞表达VEGF的影响。结果高糖可以明显增加Mailer细胞VEGF的表达，且具有一定的浓度依赖性。结论高糖促进体外培养兔视网膜MUller细胞VEGF的表达，提示高血糖作为糖尿病视网膜病变(DR)的始动因素，其可能机制之一为诱导Mailer细胞VEGF的表

2、达。[关键词]糖尿病视网膜病变；葡萄糖；视网膜Mailer细胞；血管内皮生长因子；细胞培养；免疫细胞化学糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy，DR)是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一，是患者视力丧失的主要原因，其病理特征是血一视网膜屏障的破坏以及新生血管的形成。高血糖为糖尿病慢性并发症的始动因素，其具体病理生理学机制十分复杂，目前对其尚存分歧。血管内皮生长因子(vascularendotheli-algrowth6factor，VEGF)作为主要的促血管生成及促血管通透的因子在DR的发生发展中具有重要作用。本研究拟

3、通过观察高糖对体外培养兔视网膜MUller细胞表达VEGF的影响，进一步探讨DR发生发展的机制。1　材料和方法1.1　兔视网膜Mailer细胞的体外培养按刘瑶、汪峻岭等的方法并稍加改进分离培养视网膜Muller细胞。取重约20kg的健康新西兰大白兔1只(由东南大学医学院动物实验中心提供)，耳缘静脉注入10ml空气处死后，无菌条件下迅速取出兔眼球，用含有庆大霉素的生理盐水(8万U／250m1)彻底冲洗。自锯齿缘后约1-2mm处环行剖开眼球，去除眼前部组织及玻璃体，轻轻剥取视网膜组织，DMEM冲洗粘着的色素上皮细胞(RPE)后铺平视网膜组织，体

4、视显微镜下撕下不含血管及髓放线的部分并将其剪成约1mm×1mm大小，加入DMEM培养液制成组织块悬液，离心(800r・min-1)5min后弃上清，加入含有20％胎牛血清的DMEM培养液再次制成组织块悬液，接种入培养瓶中，置入恒温湿热培养箱(37度，含5％CO2、95％空气)中培养，待组织块贴壁。每周换液2次，原代细胞生长融合至一定数量即予以传代。培养的细胞经免疫细胞化学方法证实为Mailer细胞。1.2　实验分组根据DMEM培养液中含葡萄糖浓度的不同分为5.5、10、20、30、40、50mmol・6L-16个浓度组，每组分别干预3、6和

5、9d。具体为第1代兔视网膜Mailer细胞达80％融合状态时，予以0.25％胰蛋白酶消化，用含20％胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液并调整细胞密度约为(1-2)×105ml-1，接种至预置有小玻片的6孔培养板中，置于37度，含5％CO2、95％空气的恒温湿热培养箱中培养，而后用含有不同浓度葡萄糖的DMEM培养液进行干预。1.3　VEGF免疫细胞化学分别于3、6和9d后取出部分小玻片，以pH7.2－7.6PBS清洗，冰丙酮固定；PBS冲洗，3％H2O2阻断内源性过氧化物酶；PBS冲洗，5％BSA液封闭，甩去不洗；加人兔源抗兔VEGF多抗，

6、阴性对照加PBS,4度保湿过夜；PBS冲洗，加入羊抗兔IgG二抗(亲和纯化抗体，标记有生物素)37度孵育20min；PBS冲洗，加入联袂亲和苏一生物素一过氧化物酶复合物(SABC)37度孵育20min；PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片，摄片。上述一抗、二抗SABC试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。1.4　结果判定经免疫细胞化学染色后细胞浆内有棕色或棕黄色染色为阳性着色，若无棕色或棕黄色染色则为阴性。6免疫细胞化学图像半定量分析用IPP5.0.1分析软件进行分析，每张切片任选6个视野，在每个视野内选

7、定阳性细胞范围，测定其平均光密度(meanopticaldensity，MOD)。1.5　统计学处理实验数据结果表示，组间比较采用￡检验，P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1　兔视网膜Mailer细胞形态学兔视网膜组织块培养至7d左右时，组织块贴壁并从边缘长出数个细胞伪足，而后细胞移出组织块，分裂生长。至14d左右，细胞融合近80％，此时细胞形态典型，胞体呈长梭形，胞浆丰富，胞核位于胞体中央，椭圆形，有2个或2个以上核仁。可进行消化传代培养。2.2　不同浓度葡萄糖培养条件下VEGF表达的变化2.2.1　Mailer细胞VEGF表达

8、的光镜观察免疫细胞化学染色光镜观察可见，VEGF表达阳性的Mailer细胞浆内呈阳性着色，随VEGF表达量的不同，阳性着色从淡棕色至棕黄色颗粒状不等，而阴性对照片未见阳性着色。2