苦参碱对体外培养的大鼠视网膜微血管内皮细胞的增殖及vegf表达的影响

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1、南华大学硕士学位论文苦参碱对体外培养的大鼠视网膜微血管内皮细胞的增殖及VEGF表达的影响姓名：蒋瑶祁申请学位级别：硕士专业：眼科学指导教师：彭辉灿20070501原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除Y论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文屮作了明确的说明。作者签名：日期：年月日关于学位论文使用授权说明本人同意南华大学冇关保留、使用学

2、位论文的规定，g卩：学校冇权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分A容，可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文;学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。作者签名:导师签名:日期••中文摘要苦参碱对体外培养的大鼠视网膜微血管内皮细胞的增殖及VEGF表达的影响硕士研究生：蒋瑶祁导师：彭辉灿教授目的：研究苦参碱（Matrine，Mat）对体外培养的大鼠视网膜微血管内皮细胞（ratretinalmicrovascularendothelialcells,RRMECs）的塘殖及VEGF表达的影响，明确苏可

3、否抑制视网膜微血管内皮细胞的增殖及下调VEGF的表达，为视网膜新生血管的药物防治提供新的思路和理论依据。方法：原代培养RRMECs,取第三代细胞用于实验。MTT比色法检测不同剂量Mat作用不同时间对RRMECs增殖的抑制作用；台盼蓝染色细胞计数法测定其对RRMECs生长曲线的影响；AO/EB荧光双染色法观察细胞凋亡形态学的改变。将RRMECs按如下分组处理：（1）阴性对照组：用含20%血清DMEM培养；（2）阳性对照组：含20%血清DMEM+血管抑素130mg/L（3）Mat组••含20%血清DMEM+Mat40mg/L;（4）高糖组：含

4、20%血清高糖DMEM（葡萄糖浓度25mmol/L）;（5）Mat+高糖组。免疫细胞化学和Western-Blotting检测不同分组处理48小时后细胞VEGF的表达。结果：1、MTT比色法测定结果显示:用5、10、20、40、80、160mg/L的Mat处理RRMECs,作用24h细胞增殖抑制率分别为1.42士1.03%、11.50士1.98%、24.98士2.38%、40.27士2.49%、53.54士2.39%、63.88士3.12%;作用48h细胞增殖抑制率分别为4.16士1.14%、14.40土1.78%、33.28士1.83%

5、、53.61±1.32%、63.53土1.96%、73.79土1.12%;作用72h细胞增殖抑制率分别为9.83土2.13%、22.17士4.29%、42.65士1.05%、63.17士1.38%、74.35士2.60%、87.24士4.59%。在5mg/L以上各试验组与对照组相比均具有显著性差异（P<0.05）,各试验组之间两两比较也具有显著性差异（P<0.05）。随着浓度的增高，作用时间的增加，Mat抑制细胞增殖的作用越明显，当浓度达到40mg/L,作用48小时，细胞抑制率超过了50%。细胞计数绘制生长曲线结果与MTT结果相一致。2、

6、AO/EB荧光双染色法观察:在Mat浓度达到40mg/L后处理RRMECs呈现不同程度的细胞凋亡形态学特征。3、免疫细胞化学结果显示：VEGF表达定位于胞膜和胞浆，阳性部分为棕黄色颗粒。血管抑素（130mg/L）和Mat（40mg/L）处理后其阳性表达明显降低，灰度值越少（P<0.05）且两者作用无明显差别；高糖组的VEGF阳性表达最高，灰度值也最大，Mat（40mg/L）同样能下调其表达（P<0.05）。4、Western-Blotting半定量检测VEGF蛋白的表达与免疫细胞化学的结果一致。结论：1、Mat能有效地抑制体外培养的RRM

7、ECs的增殖，在一定的浓度和时间范围内其抑制作用呈明显的剂量和吋间依赖性；2、Mat能冇效地诱导RRMECs凋亡；3、通过免疫细胞化学和Western-Blotting证实其抑制主要是通过下调VEGF表达而发生作用的，高糖能上调VEGF的表达，Mat对高糖条件下的VEGF表达同样也有抑制作用，提示Mat对糖鉍病视网膜病变等引起的视网膜新生血管防治具有一定的应用前景。关键词.•苦参碱；视网膜微血管内皮细胞；血管内皮生长因子；视网膜新生血管；免疫印迹方法；免疫细胞化学Theeffectsofmatrineoncellproliferation

8、andexpressionofintercellularVEGFinmicrovascularendothelialcellsfromratretinabyculturedinvitroAbs