大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离培养及血管形成体系

《大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离培养及血管形成体系》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、大鼠视网膜微血管内皮细胞的分离培养及血管形成体系【摘要】目的应用Matrigel建立大鼠视网膜微血管内皮细胞(RetinalMicrovascularEndothelialCells,RMECs)血管形成的体外培养体系，为进一步探讨视网膜相关疾病提供实验基础。方法体外培养RMECs，在Matrigel上建立血管形成的体外培养体系。结果经分离培养的RMECs在Matrigel上培养形成管腔样结构。结论RMECs能够在Matrigel上形成血管腔。【关键词】视网膜微血管内皮细胞;细胞培养;血管形成A

2、bstract:ObjectiveToinduceRatRetinalMicrovascularEndothelialCells(RMECs)toFormNeonMatrigel.Itentalstudyfortheretinal-relateddisease.MethodsByculturingRMECsinvitroandsettingupastableangiogenesisculturesystemonMatrigel.ResultsRMECsinaformationonMatrigel

3、.ConclusionsRMECscanbeinducedtoformmea)、胎牛血清(天津灏洋)、Ⅱ型胶原酶(Gibco)、胰酶(Biosharp)、内皮细胞生长添加物(ECGS、实验室自制)、肝素钠(上海精析)、Percol液(天津灏洋)、明胶(Sigma)、Matrigel(BectonDickison)、兔Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体(santacruz)。　　2实验方法　　2.1原代细胞分离培养参照文献[4,5]并加以改善进行细胞分离培养。①分离视网膜微血管段：SD大鼠过量乙醚处死，完整

4、摘除眼球，70%乙醇浸泡30s，沿角膜缘剪开，去除晶状体和角膜，分离出视网膜组织，除去可见的主枝大血管，于PBS中简单漂洗、剪碎。将剪碎的视网膜组织首先经过80目尼龙筛网滤过，收集网下液;再经过200目筛网，收集网上液后2500r/min离心12min，弃上清，得到视网膜微血管段。②视网膜微血管段的消化和培养：加入5～10倍体积的0.1%Ⅱ型胶原酶消化,37℃振荡水浴30～50min，吹打10min;离心，沉淀物用DMEM清洗2次，将视网膜微血管段置于事先用0.5%明胶铺过的培养瓶内,加入适量的

5、DMEM培养基(含20%胎牛血清、ECGS400μg/mL、肝素钠200μg/mL、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL)，37℃、5%CO2孵育箱培养。每日倒置相差显微镜下进行形态学观察。　　2.2传代细胞培养48h后第1次换液清除未贴壁的细胞，以后隔日换液。原代细胞长至亚融合即可传代，以0.125%胰酶(含0.01%EDTA)消化细胞，倒置相差显微镜下观察，细胞收缩变圆，即终止消化，吹打制成细胞悬液，按1:2～3接种。　　2.3RMECs的鉴定　　崔丹，等：大鼠视网膜微血管内皮细胞的

6、分离培养及血管形成体系的建立辽宁医学院学报2009年10月，30(5)2.3.1形态学观察用倒置相差显微镜直接观察细胞的生长过程及形态特点，并拍照记录。　　2.3.2免疫荧光法检测第Ⅷ因子相关抗原将培养的细胞接种于铺有盖玻片的24孔板中，细胞用4%多聚甲醛固定10min，PBS洗后，滴加0.1%Triton-100“打孔”，室温10min;PBS洗;5%BSA封闭10min，弃去不洗，滴一抗(1：300)，4℃孵育过夜;PBS洗，滴加荧光标记羊抗兔二抗(1：100)，室温1h，PBS洗，90%甘

7、油封片。荧光显微镜观察。　　2.4Matrigel上诱导血管形成Matrigel冻存于-20℃，使用前置于4℃过夜，使其融化成胶状液体备用。将Matrigel以100μL/孔滴在24孔培养板内，轻轻摇晃培养板，使其铺平。把培养板置入37℃、5%CO2孵育箱内，待Matrigel聚合，30min后即可使用。细胞消化成单细胞悬液后接种于Matrigel上，观察管腔形成情况。　　3结果　　3.1细胞形态和生长特征观察视网膜组织经筛网过滤及胶原酶消化后，得到高纯度的微血管段。原代培养时1d即开始贴壁，2

8、d时贴壁显著增多。倒置相差显微镜下观察，贴壁后可见RMECs自微血管段中游出，早期细胞呈短梭形，逐渐长成单层，呈“铺路石样”排列生长(图1)。5～7d细胞长至融合，融合的细胞大小均匀，传代细胞生长速度明显加快。　　3.2免疫荧光法检测第Ⅷ因子相关抗原经第Ⅷ因子间接免疫荧光鉴定，RMECs胞质和胞膜处呈绿色荧光(图2)，即表达较高密度的Ⅷ因子相关抗原，证实其为RMECs。　　3.3Matrigel上细胞生长状态观察在Matrigel上培养的细胞形成明显的网络状管腔样结构(图3)。　　4讨论　　内皮