大鼠血管内皮细胞的分离_鉴定及传代培养_高瑞金

《大鼠血管内皮细胞的分离_鉴定及传代培养_高瑞金》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、山东畜牧兽医2013年第34卷大鼠血管内皮细胞的分离、鉴定及传代培养*高瑞金刘学崔卫波谭海明张碧成陆倩倩张雨梅（扬州大学兽医学院江苏扬州225009）摘要为了获取大鼠血管内皮细胞供血管形成研究，建立了大鼠主动脉内皮细胞的分离培养方法。采用Wister大鼠主动脉植块法分离内皮细胞并传代培养，计数并绘制不同代次内皮细胞生长曲线。应用CD31免疫组化及内皮细胞的管形成试验对内皮细胞进行了鉴定。结果表明，主动脉植块法及传代培养获得的细胞具有内皮细胞“铺路石”样的典型特性，传代生长状态良好；CD31抗体免疫组化阳性、管形成能力良好。所建立的大鼠主动脉植块法分离及体外培养内皮细胞的体系是一种简便可行的获

2、取内皮细胞的有效方法。关键词血管内皮细胞分离培养大鼠主动脉+中图分类号：S852.163文献标识码：A文章编号：1007-1733(2013)04-0008-03血管内皮细胞是铺陈于血管内壁的一层多功能细主动脉。取出胸主动脉，用PBS冲洗3~4次后，放入另一胞，在血管通透性屏障、免疫防御及炎性反应中起着极个无菌培养皿中，用眼科镊小心除去血管周围结缔组织[1]其重要的作用。大量研究显示，血管内皮是许多心血管及脂肪，纵行剖开血管，用眼科剪分割成2mm×2mm大小疾病或危险因子作用的重要靶器官，具有相当活跃的内的血管块，将血管块内皮面向下贴于铺有明胶的50ml培分泌和代谢功能。血管内皮细胞具有多重

3、的生物学特养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中静置2h后，加入适量性，而大鼠是主要的实验动物，因此建立大鼠血管内皮含20%FBS、4ng/mlVEGF165和100μg/ml肝素的DMEM培[2-4]细胞的体外培养方法对于研究内皮细胞特性、对作用于养液培养，液体仅遮盖主动脉即可。培养4d后，弃去血管的药物及抗肿瘤药物的研究具有重要意义。本试验主动脉植块，2~3d换液1次。采用植块法分离大鼠血管内皮细胞，通过条件培养以及1.2.2传代培养原代细胞培养约12~14d，迁出生长的[3]CD31免疫组化和管形成鉴定，建立了大鼠主动脉血管内细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上时即可传代。弃去培养皮细胞的体外

4、培养方法。液，用PBS冲洗培养瓶后，加0.25%胰蛋白酶消化1材料与方法3~5min，见内皮细胞收缩变圆，立即加入等体积的含胎1.1材料牛血清的DMEM培养液终止消化，吸管轻轻吹打并混Wistar大鼠，雄性，200g左右，扬州大学比较医学中匀，移入10ml离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，心提供。人重组VEGF165，美国Prospec公司；HG-加入含10%FBS的DMEM培养液适量制成细胞悬液，分至DMEM和胎牛血清(FBS)，美国Gibco公司；兔抗大鼠2个50ml培养瓶中。根据内皮细胞贴壁时间快于成纤维细CD31抗体，美国SantaCruz公司；羊抗兔FITC荧光抗

5、胞，因此传代4h后换液以除去未贴壁杂细胞，以后隔天体，瑞士Roche公司；Matrigel基质胶，美国BD公司；换液1次。Trypsin、Pen/Strep/AmphotericinB、戊巴比妥钠、肝素1.3细胞鉴定钠，生物工程(上海)有限公司；羊抗兔即用型SABC免疫1.3.1细胞形态倒置显微镜下观察不同代次的细胞形，组化试剂盒、DAB显色试剂盒、Mayors苏木素均为武汉态，是否呈现内皮细胞典型的折光性强、“铺路石”样等特[3,5]博士德生物工程有限公司产品；EDTA、氯化钠、氯化钾点。和磷酸二氢钾，天津科密欧化学试剂有限公司；多聚甲1.3.2CD31免疫细胞分析取2代细胞，制成细胞悬液

6、后醛、甲醇、硫酸铜、碳酸氢钠和Na2HPO4·12H2O，国药集分于放有盖玻片的六孔板中，进行细胞爬片培养。待细团化学试剂有限公司。胞融合至80%左右取出盖玻片，PBS清洗3次，用4%多聚1.2方法甲醛固定30min，PBS清洗后滴加0.5%Triton-X1001.2.1大鼠胸主动脉血管内皮细胞的分离与原代培养10min；PBS清洗后加3%H2O220min，PBS再次清洗后加Wistar大鼠2%戊巴比妥钠麻醉后，经75%乙醇浸泡消毒后5%BSA封闭30min。滴加兔抗鼠CD31一抗4℃过夜，PBS固定在手术板上，在超净工作台中打开胸腹腔，分离胸代替一抗作阴性对照。第2天经PBS清洗后分别

7、滴加羊抗基金项目：江苏省大学生实践创新训练计划项目、扬州大学大学生科技创新基金资助*通讯作者82013年第4期（总第195期)试验研究兔二抗及羊抗兔FITC荧光二抗，进行DAB显色和荧光细大鼠胸主动脉血管内皮细胞进行了六代传代培养，胞分析。不同代次细胞形态上无变化，细胞生长曲线见图4。细胞1.3.3内皮细胞的管形成96孔板中先加入50μl基质胶于于分瓶后4天至对数生长期，在相同培养时间不同代次细437℃培养箱