人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定.doc

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1、人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定作者：秦明春，王若光，秦莉花，刘小丽，李春梅，刘惠萍，叶赞【摘要】目的探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养方法,提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率。建立血管内皮细胞培养模型，为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。方法取2根脐带冲净淤血，采用加工穿刺针固定脐静脉灌注消化液，一根用％胶原酶II,另一根用％胶原酶I和％胰酶等比混合消化液，比较两种酶的消化效果。收集细胞并用含有10ng/mL的VEGF的培养基中培养，观察细胞的生长及传代。并在倒置显微镜下观察细胞的形态学特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术观察细胞周期。结果两种消化酶

2、方法均获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞，胶原酶II的消化效果稍优于混合消化酶，且比较理想的消化时间均为13min,细胞接种后4〜5h开始贴壁生长，1周左右可生长成单层，光镜下呈多角形，''铺路石”样排列，免疫组织化学法可见内皮细胞胞浆中人第VO因子相关抗原呈阳性反应。细胞周期显示约有％的细胞处于G0/G1期。结论胶原酶II和胶原酶I与胰酶等比混合消化液灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法，而胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液，成功率高，可靠性大，可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。【关键词】人脐静脉内皮细胞；细胞培养；流式细胞术；细胞周期；分离；鉴定Cultivat

3、ionandinvitroidentificationofendothelialcellsfromhumanumbilicaIvEin[Abstract)0bjectiveToexploretheprimaryculturemethodofhumanvascularendothelialcells(ECs)fromumbilicalvEIn,enhancethesuccessrateofseparatingandculturingECsinvitro,establishthemodelofhumanvascularECs,andprovideanexperimentalnieth

4、odforresearchofECs.MethodsTheumbilicalveinsinhumanumbilicalcords,20cmlong,werefixedandfilledthedigestivefluids,%collagenenaseIIinonecordandthecomplexenzymeof%trypsinand%collagenaseIinanother,andthedigestiveresultswerecomparedeAllthecellswerecollectedandculturedinfluidwithlOmg/mLVEGF,theirproc

5、reationandgenerationwereobservedhemorphologiccharacteristicsofECswereobservedwithlightmicroscopyandimmunohistoehemistryunderinvertedmicroscope,andthecellcyclewasobservedbyf1oweytometer.ResuItsEnoughECswereobtainedfrombothdigestiveliquids,andcollagenenaseIIwasbetterthancomplexenzyme,theeffecti

6、vedigestingtimewasl3minutes.theculturingcellsgrewonthewallappearedafter4-5hoursandthemonolayercellswereformedafteroneweek.VIDfactorintheECsshowedpositivereactionbyimmunohistochemiststageofGO/Glumbilicalveiry.Cellcyclerevealedthat%cellswereat.ConclusionTheperfusionwithcolla(Kes〕humanvascularen

7、dothelialcellinn；cellculture；flowcytometry；cellcycle；separation；identification血管内皮细胞是位于血管内壁的单层细胞，通过产生和分泌许多血管活性物质，在维持血管舒缩、抗凝血及血管构建等方面起重要作用，同时由于其特殊的解剖学部位使内皮细胞能敏感地感知血流、压力、炎症信号以及血液循环中激素水平的变化，通过一系列的信号转导过程与邻近及远处的细胞相互联系，对各种刺激作出反应，维持机体内外环境的稳定。内皮细胞的体外