müller细胞对大鼠视网膜微血管内皮细胞增生和迁移的影响

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1、Müller细胞对大鼠视网膜微血管内皮细胞增生和迁移的影响作者：郭斌，王应利，惠延年，王雨生，马吉献【摘要】目的：用免疫磁珠法原代培养大鼠视网膜微血管内皮细胞(RMEC)，观察共培养Müller细胞对视网膜微血管内皮细胞增生和迁移的影响。方法：采用免疫磁珠的细胞分选法分离大鼠视网膜微血管内皮细胞，在条件培养基中培养生长，采用第Ⅷ因子抗体免疫组化染色方法鉴定细胞，采用流式细胞术和台盼兰染色分析传代中的微血管内皮细胞纯度以及细胞活性。传统的方法培养并鉴定Müller细胞。采用不同孔径微孔滤膜培养小室，进行大鼠视网膜微血管内皮细胞与Müller细胞分离共培养，对照组

2、培养环境中无Müller细胞。以细胞曲线描绘反映细胞增生，并用流式细胞仪测定细胞周期。相差显微镜下计算穿过微孔滤膜迁移贴附于背面的内皮细胞数量。结果：通过磁珠分离方法获得了纯度为97.13%大鼠视网膜微血管内皮细胞，细胞活力达92％，第Ⅷ因子抗体染色呈阳性。与Müller细胞共培养的RMEC可早于正常培养2～3d进入生长平台期。RMEC中S期和G2期比例增加，G1期比例相对减少。S、G2和G1期百分比，在共培养组24h分别为44.0％，11.2％和44.8％，48h分别为42.3％，10.9％和46.8％；对照培养组24h分别为41.3％，4.9％和53.8％

3、，48h分别为40.1％，4.7％和55.2％。迁移的细胞数增加，共培养6h移行至膜下的内皮细胞数12.2±2.5个，12h为51.7±23.4个，对照培养6h移行至膜下的内皮细胞3.3±2.5个，12h为14.7±7.0个，6h和12h两组内皮细胞数差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论：免疫磁珠细胞分选方法可以获得高纯度的大鼠视网膜微血管内皮细胞，且对细胞活力无影响。Müller细胞可以促进视网膜内皮细胞的迁移，促进该细胞的增生。【关键词】视网膜0引言视网膜血管形成包括血管发生（vasculoge-nesis）和血管生成（angiogenesis）形式，

4、前者是视网膜形态功能发育过程中的重要环节[1,2]，后者与许多眼底病发病相关[3,4]：如早产儿视网膜病变、增生性糖尿病视网膜病变以及视网膜静脉阻塞等。视网膜微血管内皮细胞（RMEC）是组成视网膜血管的结构单位之一，视网膜血管生成与该细胞所处状态有关，如细胞增生、移行、分化等。从细胞水平来分析视网膜血管生成内环境，可以发现RMEC受到多种周围细胞的调节，其中之一即是Müller细胞[5]。视网膜中Müller细胞是视网膜内最主要的大胶质细胞，它贯穿于视网膜各层，在调节营养神经元、排除代谢产物、维持血管稳态等方面起到重要作用[5]。目前多数A：游离细胞可结合4~

5、6个磁珠，接种于明胶包被的培养皿中；B：6d贴壁血管内皮细胞；C：第5代培养8d，内皮细胞细胞融合图2原代培养血管内皮细胞形态×100A：Ⅷ因子表达阳性；B：PECAM-1表达阳性图3视网膜血管内皮细胞免疫组化染色×100A：不规则片状,折光性暗，胞质内原纤维较丰富，胞突呈刺状分支；B：蜘蛛状Müller细胞，折光性强，胞质内原纤维较少，胞突多而长图4Müller细胞形态×100A：GFAP表达阳性；B：vimentin表达阳性图5Müller细胞免疫荧光染色×200图6Müller细胞对RMEC生长曲线的影响2.3RMEC细胞周期由于细胞中DNA成分对于外界

6、影响因子比较敏感，该实验采用无血清培养基尽量减少血清中各种生长调节因子的影响。由于Müller细胞存在使RMEC中S期和G2期比例增加，G1期比例相对减少（表1）。24h共培养组（S＋G2）％为55.2％，较无Müller细胞的对照组46.1％高。48h共培养组（S＋G2）％为53.1％，较无Müller细胞的对照组44.8％高。2.4迁移实验传入微孔滤膜培养小室的内皮细胞与在培养板内相似，可很快贴壁生长。当下室无Müller细胞时，6h移行至膜下的内皮细胞3.3±2.5个，12h为14.7±7.0个。当下室有Müller细胞存在时，迁移的细胞数明显增加，6h

7、移行至膜下的内皮细胞12.2±2.5个，12h为51.7±23.4个，与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。在24h时观察下室存在游离的细胞，多考虑RMEC迁移而入。3讨论由于体内细胞研究受到限制，所以很多人进行视网膜微血管内皮细胞培养[15,16]。传统的组织块和消化培养方法对于可获得视网膜组织量非常少的大鼠RMEC来说非常困难。本实验采用阳性筛选法纯化RMEC，以小鼠抗大鼠PECAM-1单克隆抗体与包被有小鼠IgG的磁珠孵育，使之成为具有抗大鼠PECAM-1的免疫磁珠，与RMEC表面的PECAM-1结合形成细胞磁珠复合体，经过磁场作用与其他细胞

8、分开。免疫磁珠的主要原理是利用包被的磁