骨骼肌肌细胞增殖及分化过程中凋亡现象

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1、骨骼肌肌细胞增殖及分化过程中凋亡现象　　摘要:目的对骨骼肌分化中的凋亡现象进行初步研究.方法本实验采用体外培养的C2C12肌母细胞分化模型，用流式细胞仪检测肌细胞分化过程中细胞周期的变化，提取细胞基因组DNA进行电泳分析，用原位末端标记法进行了凋亡细胞染色，电子显微镜观察凋亡小体的形成.结果C2C12细胞在肌分化诱导24h和48h，检测出凋亡现象;而对照组、肌分化诱导72h组均未检出凋亡现象.结论在肌肉分化、发育的过程中，某些细胞会按自身程序主动死亡，以凋亡细胞的形式排除，而且具有明显的时间性，终末分化的肌管不易出现凋亡.　　Ke

2、yuscle;cellapoptosis;celldifferentia-tion　　Abstract:AIMToinvestigateapoptosisintheproliferationanddifferentiationofskeletalmusclecells.METHODSMurineC2C12myoblastsdifferentialmodelent;thechangesofcellcycleetry;genomicDNAicro-scopeculturesedium，apoptosisculturesincubate

3、dfor72hoursindifferentiationme-dium.CONCLUSIONDuringthedifferentiationanddevel-opmentofskeletalmuscle，afractionofcellsmightbelostthroughapoptosisautomatically，andthismayberelatedtothetime.Differentiatedmyotubesarepossiblyresistanttoapotosis.　　0引言　　细胞凋亡近年来已成为细胞生物学研究的新领

4、域，它作为一种细胞生理性的死亡方式，在维护机体内环境稳定中起重要作用［1］.凋亡现象的研究方法很多，形态上表现为细胞固缩、染色体凝集并向核膜靠拢，最终形成新月状小体;其生化学特征则是DNA在核酸电泳时呈梯级格局［2］.凋亡概念的提出为研究胚胎发生、发展、个体形成、器官的细胞平衡增添了新的内容，指导医学实践.骨骼肌肌母细胞分化发育，首先必须退出细胞增殖周期，在多种因子的调节下，融合成具有多核的肌管结构［3］.C2C12是小鼠骨骼肌肌母细胞，20mLL-1胚牛血清的DMEM培养基可诱导其分化［4］，且骨骼肌细胞分化过程中DNA的合成以

5、及细胞周期发生明显变化［5］.我们采用C2C12细胞模型，对骨骼肌分化中的凋亡现象进行初步研究，以阐述机体骨骼肌发生、发育中肌细胞的凋亡作用，从而为进一步研究骨骼肌损伤后再生的调控奠定基础.　　1材料和方法　　1.1材料C2C12细胞（澳大利Proton教授惠赠），调整细胞密度至5×10　5L-1，接种于100mLL-1胚牛血清的DMEM（Hyclone）培养基中，在50mLL-1CO2孵育箱培养（37℃）.培养至对数期细胞随机分为对照组和实验组，对照组为生长培养基GM（100mLL-1胚牛血清的DMEM），实验组改变为分化培养基

6、DM（20mLL-1胚牛血清的DMEM），分别于24，48和72h换为分化培养基的进行实验.　　1.2方法　　1.2.1流式细胞仪对细胞的检测按文献［6］，分别取4组细胞试验，调整细胞数为1×106mL-1，4℃PBS洗涤，700mLL-1冷乙醇固定，上机前PBS洗涤细胞，加50μgmL-1碘化丙啶，1mLL-1TritonX-100，0.1mmolL-1EDTA（Na）2，50μgmL-1Rnase，4℃染色30min样品300目尼龙膜过滤，488nm氩激光激发，>610nm滤色片检测，对细胞进行分析.　　1.2.2TUN

7、EL法按原位细胞凋亡检测盒（德国宝灵曼）程序进行.常规细胞爬片，20μgmL-1蛋白酶K消化30min，洗3遍，滴加TUNEL反应液，37℃，60min，振洗后加入convert-AP，37℃，60min，最后滴加底物显色液，10min终止反应，封片，光镜下分析.凋亡细胞的胞核呈现紫蓝色，未凋亡细胞的胞核不着色.　　1.2.3电镜检测常规方法制作透射电镜标本，用TEM-200EX透射电镜观察.　　1.2.4DNA的电泳分析细胞经2.5gL-1胰酶消化，800min，离心5min收集细胞，48h漂浮细胞直接从培养液中离心收集.随之提

8、取各组细胞基因组DNA做电泳分析，在50V，30mA下，用20gL-1琼脂糖电泳2h，EB染色30min，紫外灯下观察、拍照记录.　　2结果　　2.1肌细胞分化过程中细胞周期C2C12肌细胞分化培养基培养48h的细胞周期分析中，可见凋亡峰，在图中位