骨骼肌肌细胞增殖及分化过程中凋亡现象论文

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1、骨骼肌肌细胞增殖及分化过程中凋亡现象论文.freeluscle;cellapoptosis;celldifferentia-tionAbstract:AIMToinvestigateapoptosisintheproliferationanddifferentiationofskeletalmusclecells.METHODSMurineC2C12myoblastsdifferentialmodelent;thechangesofcellcycleetry;genomicDNAicro-scopeculturesedium，apoptosisculturesin

2、cubatedfor72hoursindifferentiationme-dium.CONCLUSIONDuringthedifferentiationanddevel-opmentofskeletalmuscle，afractionofcellsmightbelostthroughapoptosisautomatically，andthismayberelatedtothetime.Differentiatedmyotubesarepossiblyresistanttoapotosis.0引言细胞凋亡近年来已成为细胞生物学研究的新领域，它作为一种细胞生理性的死亡

3、方式，在维护机体内环境稳定中起重要作用［1］.凋亡现象的研究方法很多，形态上表现为细胞固缩、染色体凝集并向核膜靠拢，最终形成新月状小体;其生化学特征则是DNA在核酸电泳时呈梯级格局［2］.凋亡概念的提出为研究胚胎发生、发展、个体形成、器官的细胞平衡增添了新的内容，指导医学实践.骨骼肌肌母细胞分化发育，首先必须退出细胞增殖周期，在多种因子的调节下，融合成具有多核的肌管结构［3］.C2C12是小鼠骨骼肌肌母细胞，20mLL-1胚牛血清的DMEM培养基可诱导其分化［4］，且骨骼肌细胞分化过程中DNA的合成以及细胞周期发生明显变化［5］.我们采用C2C12细胞模型，对骨骼

4、肌分化中的凋亡现象进行初步研究，以阐述机体骨骼肌发生、发育中肌细胞的凋亡作用，从而为进一步研究骨骼肌损伤后再生的调控奠定基础.1材料和方法1.1材料C2C12细胞（澳大利Proton教授惠赠），调整细胞密度至5×105L-1，接种于100mLL-1胚牛血清的DMEM（Hyclone）培养基中，在50mLL-1CO2孵育箱培养（37℃）.培养至对数期细胞随机分为对照组和实验组，对照组为生长培养基GM（100mLL-1胚牛血清的DMEM），实验组改变为分化培养基DM（20mLL-1胚牛血清的DMEM），分别于24，48和72h换为分化培养基的进行实验.1.2方法1.2

5、.1流式细胞仪对细胞的检测按文献［6］，分别取4组细胞试验，调整细胞数为1×106mL-1，4℃PBS洗涤，700mLL-1冷乙醇固定，上机前PBS洗涤细胞，加50μgmL-1碘化丙啶，1mLL-1TritonX-100，0.1mmolL-1EDTA（Na）2，50μgmL-1Rnase，4℃染色30min样品300目尼龙膜过滤，488nm氩激光激发，610nm滤色片检测，对细胞进行分析.1.2.2TUNEL法按原位细胞凋亡检测盒（德国宝灵曼）程序进行.常规细胞爬片，20μgmL-1蛋白酶K消化30min，洗3遍，滴加TUNEL反应液，37℃，60min，振洗后加

6、入convert-AP，37℃，60min，最后滴加底物显色液，10min终止反应，封片，光镜下分析.凋亡细胞的胞核呈现紫蓝色，未凋亡细胞的胞核不着色.1.2.3电镜检测常规方法制作透射电镜标本，用TEM-200EX透射电镜观察.1.2.4DNA的电泳分析细胞经2.5gL-1胰酶消化，800min，离心5min收集细胞，48h漂浮细胞直接从培养液中离心收集.随之提取各组细胞基因组DNA做电泳分析，在50V，30mA下，用20gL-1琼脂糖电泳2h，EB染色30min，紫外灯下观察、拍照记录.2结果2.1肌细胞分化过程中细胞周期C2C12肌细胞分化培养基培养48h的

7、细胞周期分析中，可见凋亡峰，在图中位于单倍体和二倍体峰之间（Fig1）.图1略2.2形态学观察和TUNEL法染色光镜下观察，C2C12肌细胞GM培养24h可见少量凋亡细胞，胞核呈紫蓝色，GM诱导48h凋亡细胞数量增多，存活细胞部分开始融合.对照组、GM诱导培养72h组均未见凋亡细胞，后者肌细胞融合形成的肌管增多，肌管内含多个胞核的分化现象（Fig2）.图2－图3略2.3电镜观察GM诱导培养24h和48h的C2C12肌细胞中，出现凋亡细胞，凋亡细胞核浆比例增大，核片段聚集成块堆聚在核膜周围（Fig3）.2.4细胞基因组DNA的电泳分析肌细胞于分化培养基培养24h、细

8、胞出现梯状