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1、类缺血再灌注小鼠皮质神经元DNA单链损伤与Bax表达的关系：俞英欣，万琪，张瑞国，孙文萍【关键词】脑缺血 【Abstract】AIM:TostudyDNAsinglestranddamageatdifferenttimepointsandexpressionofBaxincorticalneuronsunderischemiclikeconditionsandtoinvestigatetherelationshipoftheexpressionofBaxandDNAsinglestranddamage.METHODS:TheexpressionofBaxeterincorticalneuro
2、nsunderischemiclikeconditions.Thetreatedneuronsethodatdifferenttimepointofreperfusionforthepositiveexpressionandahalfquantitativeanalysisade.RESULTS:2hoursafterreperfusion,theexpressionofBaxreachedpeakpointandthepositiveneuronsofBaxdecreasede.TheaveragegrayofKlenoe.Thehighestaveragegrayiclikeconditi
3、ons,theexpressionofBaxreachespeakpoint2hoursafterreperfusionandsoistheDNAsinglestranddamage,suggestingthattheexpressionofBaxmayberelatedtotheDNAsinglestranddamage. 【Keyia;reperfusion;DNAsinglestranddamage;Bax;Klenoethod 【摘要】目的：研究神经元类缺血再灌注不同时间点DNA单链损伤和Bax的表达情况,探讨神经元类缺血再灌注时DNA单链损伤与Bax表达的关系.方法：利用流式细胞
4、仪对小鼠皮质神经元类缺血再灌注损伤后Bax的表达进行检测.应用Klenopus)，流式细胞仪(美国Coulter公司). 1.2方法 1.2.1细胞培养孕15d昆明种二级孕鼠,引臼脱颈处死,剖开腹部，取出胎鼠,分离胎鼠大脑脑泡外侧部的皮质,剪碎脑组织,胰酶消化,终止,以完全培养基稀释至7×108个・L-1，台盼蓝染色评估细胞活性，95%左右为存活细胞.接种于经多聚赖氨酸处理过的加有玻片的培养皿和培养瓶中,送入50mL・L-1CO2的培养箱,37℃,培养48h后,加入阿糖胞苷(10mg・L-1)以抑制非神经元的继续生长,每隔2d半量换液,培养7d后,
5、可见典型的神经元. 1.2.2神经元鉴定培养第7日的神经元细胞爬片，40g・L-1多聚甲醛固定，PBS洗后，加入βTubulin抗体和Gap43抗体染色.二抗为FITC标记的，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察计数，每种抗体计数3张爬片. 1.2.3类缺血模型建立细胞培养基换为不含糖的人工脑脊液，温度保持在(37±2)℃，混合气体换为含80mL・L-1CO2的氮气［6］.人工脑脊液配制其组成为(mmol・L-1)：NaCl123,KCl3.75,KH2PO41.25,NaHCO326,MgCl2 1,CaCl22,pH7.4. 1.2.4实验分组将培养
6、好的细胞随机分为缺血组和对照组：①缺血组,按类缺血模型处理30min.然后再换为完全培养基送入50mL・L-1CO2的培养箱,37℃，30min，1,2,3,6,12和24h取出；②对照组,未经缺血处理的细胞.上述实验及对照组均随机选取3个细胞爬片. 1.2.5DNA聚合酶ⅠKlenoL・L-1H2O2处理后，用lXKlenoin-1离心1min，收集的细胞加入50mg・L-1Saponin(Sigma公司)打孔，应用FCM洗液洗后，加入Bax抗体1h,37℃，经FCM洗液洗后，离心，加入FITC标记二抗，经FCM洗液洗后，上机检测，每组选择3个.
7、 统计学处理：实验结果以x±s表示.Klenow法和流式细胞仪结果的各时间点采用方差分析进行研究，各组与对照比较采用Duntt检验.流式细胞仪Bax阳性率与Klenow方法所得结果采用直线相关分析. 2结果 2.1βTubulin和Gap43染色βTubulin染色结果阳性率为（0.83±0.20）%，Gap43染色结果阳性率为（0.79±0.01）%. 2.2Klenow法检测未经缺血处理
