丹红注射液对大鼠皮质神经元体外模拟缺血再灌注损伤的保护作用

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1、丹红注射液对大鼠皮质神经元体外模拟缺血再灌注损伤的保护作用：张红张睿张小乔徐江华李琴梅元武【摘要】　　目的探讨体外模拟缺血再灌注后大鼠皮质神经元内质网应激诱导凋亡的机制及丹红注射液对其的干预作用。方法体外培养大鼠皮质神经元，神经元特异性烯醇酶（NSE）鉴定神经元纯度。建立体外培养大鼠皮质神经元模拟缺血再灌注模型，随机分为对照组（始终正常培养）、缺血再灌注组（体外模拟缺血再灌注）、治疗组（缺血再灌注加丹红注射液干预），应用免疫组织化学、免疫荧光染色方法鉴定神经元纯度；流式细胞术AnnexinV、PI双标检测神经元凋亡率及活性半胱天冬酶(Caspase)3、Caspase8、C

2、aspase9蛋白表达；ethodsRatcorticalneuronsmunohistologicalstainingandimmunofluorescencestaining.Neuronalischemia/reperfusionmodelsinvitroiafor6hinEarle’sberosphereof0.05CO2,0.95N2at37℃,reperfusionedbyremovingneuronalculturetheanaerobicchamberandaddingnormalmediumtoanincubatorosphereof0.05CO2、0.95

3、airat37℃.PercentageofapoptoticcellsandexpressionlevelsofactiveCaspase3,9,8inedbyfloetricanalysis.ProteinlevelsofGRP78,Bcl2,CytCandactiveCaspase12munoblotting.ResultsTheapoptosisrateinducedafterreperfusion24hand48hL/L)respectively(χ2=7.164,10.650;P<0.05).ProteinlevelsofGRP78andCaspase

4、12incorticalneuronsinresponsetoischemia6handreperfusion24hor48hia/reperfusionbutthereleasedofcytochromecia/reperfusioninvitro.Danhonginjectioncaninhibitapoptosiscausedbyanalogousischemia/reperfusion(IS/RE)invitroinratcorticalneurons.　　［KEYedSystems公司；AntiCaspase12、AntiGRP78多克隆抗体分别购自Stres

5、sgen公司；ActiveCaspase3、Caspase9、Caspase8试剂盒购自BioVision公司；Bcl2、细胞色素C试剂盒购自SantaCruzBiotechnology公司；NSE组化检测试剂盒购自北京中山公司；其他试剂均为市售分析纯。CO2恒温细胞培养箱(Napco5410220，USA)；荧光倒置显微镜（Olympus，JAPAN)；全自动酶标分析仪(ThermoElectronCorporationMultiskanMK3，USA)；流式细胞仪（FACSCLSR，BectonDickton，USA)；激光扫描共聚焦显微镜(OlympusFlu

6、ovieagingSystem，日本Olympus公司)。　　1.2方法　　1.2.1皮质神经元培养与鉴定取出生24h以内SD大鼠皮质于冷解剖液（4℃）中，剥离脑膜、血管，将脑组织剪成小于1mm×1mm×1mm的组织块,37℃水浴消化20min,加种植培养液(DMEM中添加体积分数0.10胎牛血清及体积分数0.10马血清，pH7.2～7.4)终止消化并吹打,细胞悬液经200目滤网过滤,获得单细胞悬液，将1×106个细胞接种于预先包被多聚赖氨酸的35cm培养皿。第2天更换维持培养液（Neuronbasal加体积分数0.02B27），培养3～5d半量换液，7～10d用于实验。NSE

7、免疫组织化学染色和IgG免疫荧光染色(FITC标记的兔抗鼠IgG1∶200稀释)鉴定神经元。　　1.2.2丹红注射液对原代神经元活力的影响采用MTT法检测。取前述原代神经元（细胞密度1×106/L），按每孔100μL接种于96孔板，培养5d后随机分为空白对照组、阴性对照组、实验组，每组5个平行孔。实验组神经元加丹红注射液，终浓度分别为0.8、8.0、80.0mL/L，分别继续培养1、2、3d，每孔加入MTT15μL，37℃孵育4h，镜下观察形成紫色针状结晶,小心弃去上清,每孔加入DMSO10