toll样受体4对脑缺血再灌注小鼠皮质trif表达的影响

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1、Toll样受体4对脑缺血再灌注小鼠皮质TRIF表达的影响【摘要】目的探讨Toll样受体4（TLR4）对脑缺血再灌注小鼠皮质TRIF表达的影响。方法小鼠随机分为3组，分别为假手术组和缺血再灌注组、TLR4阻断组，各组又分1、2、3、4d4个时间点组。采用TLR4抗体封闭阻断TLR4，Western印迹检测皮质TLR4蛋白、干扰素β(IFNβ)蛋白表达量，免疫组化方法检测TRIF表达变化。结果缺血再灌注组TLR4蛋白、IFNβ和TRIF表达水平明显高于假手术组表达水平（P<0.05），而TLR4阻断组TLR4蛋白、

2、IFNβ和TRIF表达水平明显少于缺血再灌注组（P<0.05）。结论缺血再灌注可激活TLR4，并引起TRIF和IFNβ表达量增加，而采用TLR4抗体封闭阻断TLR4后，TRIF和IFNβ表达量减少，提示TLR4通过上调TRIF表达参与脑缺血再灌注的反应机制。【关键词】脑缺血再灌注；TLR4；TLR4阻断；TRIF；IFNβ【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofTolllikereceptor4（TLR4）ontheexpressionofTRIFduringtheinfl

3、ammatoryreactioninducedbycerebralischemiareperfusioninmice.MethodsAfterblockadeofTLR4byTLR4antibody，theexpressionofTLR4andinterferon(IFN)βattheproteinlevelincortexwasexaminedbyWesternblotrespectively.The9expressionofTRIFwasmeasuredbyimmunohistochemistrystain.Mice

4、wererandomlydividedintoshamgroup,ischemiareperfusiongroupandTLR4blockinggroupindifferenttimepoints（1,2,3dand4d）.ResultsIntherightcortex,TLR4protein,IFNβandTRIFexpressionofischemiareperfusiongroupwasdistinctlyhigherthanthatofshamandTLR4blockinggroup（P<0.05）.Con

5、clusionsTLR4participatesincerebralischemiareperfusionbyupregulatingtheexpressionofTRIF.【Keywords】Cerebralischemiareperfusion;TLR4;TLR4blocked;TRIF;IFNβ　　Toll样受体4(TLR4）信号通路包括髓样分化因子88(MyD88)依赖性(MyD88途径)和MyD88非依赖性（TRIF依赖性）两个途径〔1，2〕。TRIF为TLR4MyD88非依赖性信号转导途径中的主要接头蛋白

6、。目前，对TLR4介导的TRIF依赖信号通路的研究主要集中在抗感染免疫反应中〔3，4〕，在脑缺血再灌注过程中该信号途径是否发挥作用还没有相关报道。本研究通过观察脑缺血再灌注损伤是否激活TLR4及采用TLR4抗体阻断TLR4后，其胞内衔接蛋白TRIF的表达，探讨TLR4参与脑缺血再灌注的反应机制。　　1材料与方法9　　1.1主要试剂　　兔抗TLR4单克隆抗体（sc16240）、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗、βactin抗体、山羊抗IFNβ单克隆抗体IgG（sc17569）（美国SantaCruz公司）；兔抗TR

7、IF单克隆抗体IgG（1866115184）（美国Geneway公司）；免疫组化染色试剂盒（SP9001）（北京中山公司）。　　1.2实验动物的分组　　健康昆明种小鼠144只，雌雄兼用，体重18～22g，由中国医科大学实验动物中心提供随机分为3组：(1)假手术组（n=48）；(2)缺血再灌注组（n=48）；(3)TLR4阻断组（n=48）。各组又分1、2、3及4d4个时间点组（n=12）。　　1.3小鼠脑缺血再灌注模型的制备　　手术在室温25℃、湿度50%的条件下进行。用2%戊巴比妥钠腹腔注射（40mg/kg），络合

8、碘消毒，行颈部正中切口，分离两侧颈总动脉（CCA)，用动脉夹夹闭小鼠双侧CCA，阻断129min后，松开动脉夹实现再灌注。在阻断双侧CCA血流后，出现心跳加快、呼吸幅度加深、频率先加快、后减慢典型生理变化过程的小鼠为缺血成功样本入选。TLR4阻断组小鼠缺血10min时在右侧CCA内缓慢注入TLR4抗体(