检测牛病毒性腹泻病毒的real

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1、检测牛病毒性腹泻病毒的Real　　牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovineviraldiarrhea/mucosaldisease,BVD/MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus,BVDV)引起的牛等动物的重要传染病。受感染牛可表现出多种临床症状,包括肺炎、腹泻、流产、出血性综合征等急性感染及持续性感染和黏膜病,同时,由于BVDV引起的免疫抑制可造成继发感染和其他疫苗免疫失败。据统计,在每100万犊牛中,由于BVDV感染造成的损失可达2000~5700万美元。该病毒除感染牛外,还

2、可以感染鹿、羊驼、牦牛、骆驼等特种动物,对特种经济动物养殖危害较大。　　BVDV基因组核酸为单股、正链RNA,长约12.3kb,由5'端非编码区(5'UTR)、1个大的开放阅读框(ORF)和3'端非编码区(3'UTR)构成。大开放阅读框序列编码着所有的病毒蛋白,单个病毒蛋白的顺序为Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2/3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B,多聚蛋白体形成后,经宿主细胞和病毒自身的多种蛋白酶进行翻译和翻译后加工,生成不同的病毒蛋白。依据5'

3、UTR基因序列可将牛病毒性腹泻病毒分为2个基因型,即BVDV1和BVDV2。最近,典型牛瘟病毒(包括Th/04KhonKaenvirus,D32/00-HoBi等)被定义为BVDV3型。根据能否使细胞发生病变效应将BVDV分为致细胞病变型CP和非致细胞病变型NCP2种生物型。临床上分离毒株多为非致细胞病变型。感染非致细胞病变型BVDV的小牛血清已成为生物制品生产中较大的威胁。因此,快速准确地检测BVDV成为预防和控制牛病毒性腹泻的关键。常规检测BVDV的技术主要有病毒分离、血清学试验等。这些方法对于临床上无细

4、胞病变毒株的诊断在敏感性、特异性、时效性等方面都存在各自的缺陷。用于病毒核酸检测的Real-timePCR技术以其快速、灵敏、特异性强等优点在基因表达水平的分析、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用。本研究建立了检测BVDV的SYBRGreenⅠReal-timePCR方法,并对临床感染牛体内BVDV进行定量检测,揭示病毒在宿主体内各脏器的分布情况。　　1、材料和方法　　1.1病毒　　牛病毒性腹泻病毒JL毒株(BVDV-1)、牛病毒性腹泻病毒HEN03毒株(BVDV-2)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、

5、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛副流感病毒(PI3V)、猪瘟病毒C株(CS-FV-C)均由中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学重点实验室分离鉴定并保存。　　1.2主要仪器和试剂　　PCR仪、Bio-rad实时荧光定量PCR仪、ExTaq酶、pMD18-T载体(大连宝生物工程公司),Tr-izol、反转录试剂盒(Invitrogen公司),质粒提取与胶回收试剂盒(AXYGEN公司)。　　1.3引物的设计与合成　　通过序列比对,根据牛病毒性腹泻病毒5'UTR基因保守序列,利用Oligo6.0软件

6、设计了1对引物。　　上游引物BF(5'GGTAGCAACAGTGGTGAGTTC3'),下游引物BR(5'CTCAGGTTAAGATGTGCTGTG3'),扩增片段136bp,引物由上海生物技术服务有限公司合成。　　1.4病毒RNA提取和cDNA的合成　　采用Trizol试剂提取病毒的RNA,提取步骤参照使用说明书进行。提取的RNA溶于30μLDEPC处理的ddH2O,反转录按照Invitrogen反转录试剂盒说明进行。　　1.5标准品的制备　　利用1.4项下合成的牛病毒性

7、腹泻病毒cDNA作为模板进行常规PCR,反应体系25μL:cDNA模板2μL、上下游引物(10pmol)各1μL、dNTP(2.5mM)2μL、10ExBuffer2.5μL、ExTaqTMDNA聚合酶0.25μL、ddH2O16.25μL。反应条件:95℃5min,94℃30s,56℃30s,72℃20s,35个循环,最后72℃延伸7min。RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,目的DNA片段连接pMD18-T载体转化后挑单克隆提取质粒送测序,序列正确质粒利用紫外分光

8、光度计测其D260nm和D280nm值,并计算出每微升拷贝数。　　1.6SYBRGreenⅠreal-timePCR反应条件　　将质粒标准品10倍倍比梯度稀释,并进行Real-timePCR反应,反应体系按照SYBRPremixExTaqTM(PerfectRealTime)试剂盒说明书进行,反应条件:95℃预变性10s;95℃5s,60℃20s,共40个循环,每个循环结束时检测荧光信