牛病毒性腹泻病毒山东株的分离与鉴定

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1、牛病毒性腹泻病毒山东株的分离与鉴定牛病毒性腹泻病毒山东株的分离与鉴定摘要：牛病毒性腹泻病毒是牛病毒性腹泻-黏膜病的重要病原体，该病毒病是极为复杂、呈多临床类型表现的传染病，给世界养牛业造成了巨大的经济损失。本研究从疑似牛病毒性腹泻-黏膜病的粪便中分离得到一株病毒能使MDBK细胞产生细胞病变，经RT-PCR检测及扩增产物测序进一步证实，该病毒为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒，TCID50测定该病毒的滴度为107.15TCID50/mlo该病毒株的分离鉴定为牛病毒性腹泻病毒疫苗的研制奠定了基础。关键词：牛病毒性腹泻-粘膜病病毒；分离

2、；鉴定中图分类号：S852.65+3文献标识号:A文章编号:1001-4942(2013)02-0041-04牛病毒性腹泻-黏膜病(BovineViralDiarrhea-MucosalDisease,BVD-MD)是rh牛病毒性腹泻病毒(BovineViralDiarrheavirus,BVDV)感染而引起的一种重要传染病，临床上以发热、腹泻、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、持续感染与免疫耐受、免疫抑制、怀孕母牛流产、产死胎和畸型胎以及致死性黏膜病为主耍特征［1,2］。该病呈世界性分布，广泛存在于美国、澳大利亚、英国、新西兰

3、、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度等国家［3］oBVDV不仅可感染牛，也能感染绵羊、山羊、猪、鹿和其它反刍动物。1946年美国人Olafson等首次发现并分离出BVDV,1983年我国李佑民等首次从流产胎儿的脾脏中分离到BVDVoBVDV属于黄病毒科(Flaviviridae),瘟病毒属(Pestivirus),与猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus,CSFV)和绵羊边界病毒(BorderDiseaseVims,BDV)同属，存在抗原相关性，在血清学上存在着交叉反应，而且能够突破彳首主特异性发生交叉

4、感染［4］。根据BVDV病毒基因组5,端非翻译区⑸NTR)序列比较,把BVDV分为牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV-I)和牛病毒性腹泻病毒I［型(BVDV-II)［5,6］o根据BVDV可否使体外培养的传代上皮细胞发生病变效应，可分为两个生物型(biotype)：致细胞病变型(cytopathic,CP)和非致细胞病变型(noncytopathic,NCP)［7］。两种生物型的病毒虽然与宿主细胞的作用不同，但BVDV只有一种血清型。BVDV感染情况复杂，持续性感染个体症状隐蔽。动物带毒率高，特别是BVDV严重影响感染动物的繁

5、殖，因此给全球畜牧业造成了巨大的经济损失［8］。因而被世界动物卫生组织(0IE)列为发病必须上报的动物传染病2—。本研究采集山东省某牛场发生严重腹泻症状的病牛的粪便，并对其进行了分离和鉴定，BVDV山东株的获得为BVDV疫苗的研究奠定了基础。1材料与方法1.1材料牛肾细胞(MDBK)由山东省农业科学院奶牛研究中心实验室保存；DNAMarkerDL2000购于上海生工生物工程技术服务有限公司；DMEM细胞培养基、新生马血清、胰蛋白酶为HyClone公司生产；MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit,

6、TaKaRapimeScriptTMRT-PCRKit,LATaq酶,dNTP,RNA酶抑制剂，均购于宝生物工程(大连)有限公司。病料样品为山东省某牛场发生严重腹泻症状的病牛的粪便。1.2病毒培养1.2.1病料的处理取腹泻奶牛粪便，用PBS(含10%双抗)1：5稀释。3000r/min离心10min,得到的上清液经0.22um滤膜过滤除菌后得到病料处理液。1.2.2病毒的接种选择生长旺盛的MDBK单层细胞,弃去营养液。按细胞培养瓶1%的量接种病料处理液后37°C感作1h,弃去感作液，加入维持液(2%新生马血清的DMEM)于

7、5%C02、37°C培养。12h观察细胞病变，培养24h后收毒。细胞毒反复冻融3次后再次接种MDBK细胞，如此传3代，收获的细胞毒用于其它试验。1.3RT-PCR鉴定及序列测定分析1.3.1引物的设计合成根据已发表的BVDVNADL株、0sloss株、OrengonC24等毒株的全序列的巳UTR保守区设计BVDV检测引物及分型引物［9,10］,引物序列信息见表1,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。稀释成20umol/L,-20°C保存。