[精品]牛流行热病毒山东地方株的分离与鉴定

《[精品]牛流行热病毒山东地方株的分离与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、牛流行热病毒山东地方株的分离与鉴定牛流行热病毒山东地方株的分离与鉴定摘要:利用BHK-21细胞，接种山东济南地区疑似牛流行热病牛高热期的抗凝血，经盲传3代，分离到1株病毒，经RT-PCR鉴定为牛流行热病毒，命名为BEFV-SDo理化特性试验表明：BEFV-SD对热敏感，56°C10min、37°C18h可被灭活，对乙醍、氯仿等敏感；BEFV-SD可被BEFV阳性血清中和,中和效价为1：408；将BEFV-SD的G基因与GenBank中公布的BEFV进行同源性比较，同源性达到96.3%以上。关键词：牛流行热病毒；分离；鉴定；同源性中图分类号:S855.3文献标识号

2、文章编号：1001-4942(2013)02-0031-04牛流行热(BovineEphemeralFever,BEF)是市牛流彳亍热病毒(BovineEphemeralFeverVirus,BEFV)引起的牛和水牛的一种急性、热性传染病，其特征是突发高热、呼吸迫促、消化机能障碍、全身虚弱、僵硬、跛行［1］。首先发现于19世纪中期的东非，随后流行于非洲、亚洲和大洋洲许多国家和地区［2〜5］。本病流行具有明显的季节性，多发生于雨量多和气候炎热的7〜10月。该病传播迅速，流行面广，有一定的周期性［6］,曾在我国多个省份多次发生，导致奶牛产奶量降低，乳品质下降，役用牛

3、跛行或瘫痪，部分怀孕母牛流产，给养牛业造成重大经济损失。本实验室采集了疑似患牛流行热病牛高热期的抗凝血，进行了病原分离，经各项试验鉴定，证实分离获得了牛流行热病毒。1材料与方法1.1实验材料1.1.1病料来源采集山东省济南市周边出现急性发热、呼吸道和消化道机能障碍的奶牛高热期的静脉血，月T索钠抗凝，-20°c保存。1.1.2实验材料100mm培养皿、96孔培养板为Costar产品,DMEM营养液、胎牛血清购自Giboco公司，RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、DL2000DNAMarker等分子生物学试剂购口大连宝生物工程公司，琼脂糖、澳化乙月定等试剂购自上

4、海生工生物技术有限公司，BHK-21细胞为山东省农科院奶牛研究中心实验室保存。1.1.3引物设计与合成根据牛流行热病毒主要免疫保护性糖蛋白G(BEFV-G)的保守核甘酸序列(GenBank登录号为AF234533.1)设计引物BEFJ1(5‘-AGAGCTTGGTGTGAATAC-37)和BEFJ2⑸-CCAACCTACAACAGCAGATA-37),扩增片段大小为420bp,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.2方法1.2.1病毒的分离与传代将临床疑似牛流行热的病牛抗凝血反复冻融3次后，4°C离心(4000r/min)5min后取上清，接种于长满单

5、层的BHK-21细胞，37°C吸附lh,加入含有2%胎牛血清的DMEM细胞维持液，连续3d观察是否出现细胞病变(CPE),若未发生CPE盲传3代，仍未出现CPE且RT-PCR鉴定为阴性者废弃，阳性者继续传代，直至出现CPE,当出现80%CPE吋收毒，冻融3次后，继续传代3次。经无菌检验合格后，小管分装，-70°C冻存备用。并按方法1.2.2进行病毒的RT-PCR鉴定。1.2.2RT-PCR检测病牛的抗凝血及培养病毒液反复冻融3次后,用病毒RNA提取试剂盒提取RNA,反转录cDNA,进行PCR扩增。PCR反应体系为：10Xbuffer2.5n1,25mmol/LM

6、gC121.8u1,10mmol/LdNTPs0.5pl,上、下游引物(10umol/L)各0.7P1,模板DNA1.5u1,TaqDNA聚合酶(5U/u1)0.4u1,加三蒸水至25uloPCR反应条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s,56°C复性30s,72°C延伸30s,35个循环；最后72°C延伸3min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.3病毒理化特性试验对分离毒种的第6代BHK-21细胞培养物进行理化特性鉴定，用终浓度50mg/L的5-碘脱氧尿核甘处理分离毒种，鉴定病毒的核酸型；用乙瞇、氯仿处理分离毒种，进行脂溶性敏感试验

7、；用pH3.0的盐酸处理分离毒株进行耐酸性试验；56°C水浴10-30min,37°C孵育12-36h,对分离毒株进行耐热性试验，同吋分别设立对照组。1.2.4中和试验采用固定病毒稀释血清的方法，将200TCID50/100U1分离株病毒液与等量的不同倍比稀释度的BEFV阳性血清充分混合，37°C感作1h,将每个混合液接种于弃去生长液的长满单层BHK-21细胞的96孔细胞培养板中，37°C吸附lh后，每孔加细胞维持液100u1,置于37°C、5%C02培养箱静置培养7d,逐H观察CPE情况并记录。同时设立血清毒性对照、阴性血清对照和空口试验对照。1.2.5分离病

8、毒株的G蛋白编码区的克隆