致犊牛肺炎牛支原体南疆株的分离鉴定及oppf基因序列分析

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1、中国畜牧兽医２０１４年第４１卷第１２期生物技术·２５·致犊牛肺炎牛支原体南疆株的分离鉴定及ｏｐｐＦ基因序列分析杨铭伟，李迪，赵海龙，剡根强，王静梅（石河子大学动物科技学院，新疆石河子８３２００３）摘要：本研究旨在调查新疆喀什某规模化奶牛场的犊牛死亡原因，并确定病原体。无菌采集３份因肺炎死亡的犊牛肺脏病料样品。采用牛支原体专用液体培养基和１．０％牛支原体琼脂固体筛选培养基从３份病死犊牛肺脏病料中分离得到２株牛支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｂｏｖｉｓ，Ｍ．ｂｏｖｉｓ），分别命名为Ｍ．ｂｏｖｉｓ－ＮＪ－１和Ｍ．ｂｏｖｉｓ－ＮＪ－２。通过菌落形态学观察、特异性ＰＣＲ和ｏｐｐ

2、Ｆ测序比对对分离株进行鉴定。结果显示，２个分离株在固体培养基上的菌落呈现典型的“煎蛋状”，且Ｄｉｅｎｅｓ染色特点符合牛支原体菌落着色特征，中心呈深蓝色；ＰＣＲ能扩增出牛支原体特异的４４８ｂｐ目的片段；２个分离株的ｏｐｐＦ基因序列与牛支原体国际标准株ＰＧ４５的同源性分别为９６．７％和９５．３％。结果表明，引起犊牛发病死亡的病原是牛支原体，本研究为犊牛支原体肺炎的快速诊断和防制提供依据。关键词：犊牛支原体肺炎；牛支原体；分离；ＰＣＲ鉴定；ｏｐｐＦ中图分类号：Ｓ８５８．２３文献标识码：Ａ文章编号：１６７１－７２３６（２０１４）１２－００２５－０５牛支原体（Ｍｙｃｏｐｌａ

3、ｓｍａｂｏｖｉｓ，Ｍ．ｂｏｖｉｓ）是一种原的分离培养与鉴定，为牛场进一步的治疗提供第可导致牛发生肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎、耳一手资料。炎、生殖道炎，甚至流产与不孕等多种疾病的重要致１材料与方法病性病原体，在环境等其他应激因素的作用下还可１．１菌株和病料牛支原体ＳＨＺ株由石河子大学引起多种疾病的继发感染。中国自２００８年开始在动物免疫学实验室分离、鉴定、保存；绵羊肺炎支原湖北省等不同地区相继暴发了牛支原体病疫情（石体Ｙ９８由石河子大学动物免疫学实验室保存。因磊等，２００８ａ；辛九庆等，２００８；胡长敏等，２００９），２０１０肺炎死亡犊牛肺脏病料３份，采自新疆

4、喀什某规模年７月以来，新疆石河子、奎屯等某些规模化奶牛场化奶牛场。部分犊牛陆续发生一种以高热、呼吸道症状、胸膜肺１．２主要设备、试剂及溶液生物安全柜（ＢＨＣ－炎和膝关节肿大为特征的牛支原体病疫情（姚永进Ⅱ－Ａ／Ｂ３型）购自Ｂａｋｅｒ公司；ＣＲ２２Ｅ高速冷冻离等，２０１１）。目前该病在世界范围内广泛存在，发病心机购自日立公司；ＣＯ２培养箱购自ＴｈｅｒｍｏＳｃｉ－率和死亡率较高，每年给世界养牛业带来巨大的经ｅｎｔｉｆｉｃ公司；ＰＣＲ扩增仪购自Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司；电泳凝济损失，严重影响和制约着各国养牛业的发展胶成像系统购自ＰｈｏｔｏＦｉｌｍ公司；体式显微镜（Ｎｉｃｈｏｌ

5、ａｓ等，２０００，２００３；Ｓｔｉｐｋｏｖｉｔｓ等，１９９９）。（Ｍ１６５Ｃ／ＤＦＣ４２０型）购自Ｌｅｉｃａ公司。ＤＮＡ提取２０１３年以来，新疆喀什某规模化奶牛场１～２月龄试剂盒、ＰＣＲ试剂盒、ＤＮＡ胶回收试剂盒均购自天犊牛群陆续发生以肺炎为临床特征的疾病，发病率根生化科技（北京）有限公司；ｐＭＤ１９－Ｔ购自ＴａＫａ－为３７％～４０％，且病程较长，犊牛生长缓慢，采用多Ｒａ公司；胎牛血清为无支原体血清，购自北京鼎国种抗生素治疗，效果不明显，病死率为６％～１２％。生物公司；牛支原体专用液体培养基和１．０％牛支为了确定致该牛场犊牛肺炎的病原体，本研究对无原体琼脂固体筛选

6、培养基均由石河子大学动物免疫菌采集的３头因肺炎死亡的犊牛肺脏组织进行了病学实验室配制。Ｄｉｅｎｅｓ染液配方为：美蓝２．５ｇ，天青Ⅱ号１．２５ｇ，麦芽糖１０ｇ，碳酸氢钠０．２５ｇ，苯甲酸收稿日期：２０１４－０７－３０作者简介：杨铭伟（１９９０－），男，河南人，硕士生，研究方向：动物０．２ｇ，硫柳汞０．０１ｇ，去离子水１００ｍＬ配制成贮传染病诊断与防治。藏液，将贮藏液用去离子水稀释成３％，经０．２２μｍ通信作者：剡根强（１９５８－），男，甘肃人，教授，博士生导师，主要滤膜过滤即为工作液（吴移谋等，２００８）。从事动物传染病的诊断与防治研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｇｑ５８＠ｓ

7、ｈｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ１．３病原的分离培养基金项目：国家科技支撑计划（２０１２ＢＡＤ４３Ｂ０２）。１．３．１肺脏病料处理无菌条件下，剪切肺脏组织·２６·生物技术中国畜牧兽医２０１４年第４１卷第１２期典型病变或坏死区域边缘组织样品１～２ｇ，加入引物由北京六合华大基因股份有限公司合成。１．５ｍＬ牛支原体专用液体培养基，以灭菌剪刀剪１．５．４ＰＣＲ反应以１．５．２制备的基因组ＤＮＡ碎，并用组织匀浆器充分碾磨粉碎，将组织匀浆液转作为ＰＣＲ模板，利用引物Ｐ１、Ｐ２进行ＰＣＲ扩增。移到微量离心管中，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后取上ＰＣＲ反应体系２０μＬ：模板３μＬ，Ｐ１、

8、Ｐ２各０．