牛病毒性腹泻病毒e0基因重组乳酸菌的制备及其免疫效果检测

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1、分类号：墨墨量2：2密级：公珏单位代码：!QQ逝学号：2Q!Q垒25牛病毒性腹泻病毒EO基因重组乳酸菌的制备及其免疫效果检测PreparationofBVDVEOGeneRestructuringL．acidopHilusandDetectionofProtective1rlmmunltV学位申请人：指导教师：学科专业：学位类别：授予单位：答辩日期：蒋禄峰赵月兰教授预防兽医学农学硕士河北农业大学二。一三年六月一日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的

2、研究成果，也不包含为获得塑i垦盔些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：蒋榻字日期：砷f≥年石月f日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑a鱼盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者躲蒋撩晦签字日期：沙J弓年莎月f目学

3、位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：导师签名：，赵A弓签字日期：弦B年莎月7日电话：邮编：摘要牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒引起的临床上以发热、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、腹泻、母畜流产或产畸型胎儿为主要特征。近年来我国乳牛进口数量急剧增加，该病已成为当前严重危害我国养殖业的传染病之一，给畜牧养殖业造成极为巨大的经济损失。对于本病目前仍无特效的治疗方法，因此加强对本病的研究就显得尤为重要。根据G铋balll【上发表的牛病毒性腹泻病毒OregonC24V株EO基因的核苷酸序列设计一对特异性引物，应用PCR技术扩增牛病毒性腹泻病毒HB—DCZ株E0基因。将PCR产物克隆到

4、pMDl9．T载体，克隆产物进行序列测定与分析。结果：HB．DCZcDNA体外扩增获得特异性条带，大小约为687bp。序列测定结果表明，HB—DCZ株EO基因由681个核苷酸组成，编码227个氨基酸。与已公开发表的BVDV其他毒株核苷酸和推导氨基酸序列同源性性依次为：CCSYD99％、QHZKl098．4％以及VEDEVAC98．2％、C24V80．9％、Yak74．2％。HB．DCZ与CCSYD、QHZKl0以及VEDEVAC株的遗传距离较近，与国际标准毒株C24V、Yak株的遗传距离较远。运用Kyte．Doolittle方案预测氨基酸的亲水性，采用Karplus．Schu

5、lz方案预测蛋白质的柔性区域，按Jameson．Wolf方案预测抗原指数，利用Emini方案预测蛋白质的表面可及性。对预测结果综合分析，推测最有可能的B细胞表位位于N．端6—17，23．29，47．53，59—68，70．81，97-109，114-122，127一134，137-143，165-172，186·198，213．220。通过Sac／、Hin彻限制性内切酶双酶切将目的基因EO整合入穿梭表达载体pMG36e中，连接产物通过KCM法转化到大肠杆菌DH5a中。提取阳性大肠杆菌pMG36e-EO／DH5a质粒进行双酶切及PCR鉴定；SDS．PAGE电泳和Western-

6、blotting分析EO蛋白质的表达情况。从重组大肠杆菌中扩增得到68top片段E0基因及经双酶切鉴定证明E0基因已经插入pMG36e载体中，构建的pMG36e．E0表达载体成功转入大肠杆菌中，表达出分子量约为27kDa的蛋白质，与核苷酸序列推断的蛋白大小相符。因此，成功构建了牛病毒性腹泻病毒EO表达载体，并在大肠杆菌中获得蛋白表达。采用电转化技术将己构建的牛病毒性腹泻病毒E0基因大肠杆菌重组表达质粒pMG36e．E0转化至嗜酸乳杆菌LA．5中。筛选阳性克隆。提取重组质粒进行双酶切鉴定与PCR鉴定；SDS．PAGE电泳和Western-blotting分析EO蛋白质的表达情况

7、；对克隆菌进行遗传稳定性试验，分析重组质粒在嗜酸乳杆菌中的稳定性。从重组嗜酸乳杆菌中扩增得到一条大小约为690bp的片段及经双酶切鉴定证明pMG36e-E0表达载体成功电转化入嗜酸乳杆菌中，表达出分子量约为27kDa的蛋白质，与核苷酸序列推断的蛋白大小相符。证明牛病毒性腹泻病毒E0基因嗜酸乳杆菌表达系统被构建成功并获得蛋白表达。将重组pMG36e．E0嗜酸乳杆菌给乱8周龄的BALB／c小鼠灌服，每次连续口服免疫3d，每次免疫时间间隔为2周，共免疫3次。分别于免疫前、一免l、2、7d；二免前、二免1、2、