牛分支杆菌ag85a基因重组乳酸菌的构建及免疫研究

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1、分类号：Q78单位代码：10193密级：公开学号：2012623硕士学位论文牛分支杆菌ag85a基因重组乳酸菌的构建及免疫研究ConstructionandimmunologyresearchofRecombinantLactobacilluswithag85ageneofM.bovis作者姓名：刘鑫学位类别：硕士专业名称：预防兽医学研究方向：动物免疫学指导教师：姜秀云所在学院：动物科学技术学院2015年05月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的

2、研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/

3、不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要牛结核病（Bovinetuberculosis）是一种威胁着人类健康、妨碍着畜牧业发展的慢性消耗性人畜共患传染病。牛结核病的传染成全球性，发病没有明显的季节性，宿主十分广泛牛最易感，人、猪、禽类和野生动物也可患病。人类与牛通过牛的饲养、牛产品的消费等多种途径上密切联

4、系着，迫使人类容易感染就结核病，人类的健康受到严重威胁。目前为止，预防结核病的惟一有效的疫苗仍为卡介苗（BCG）。由于BCG的免疫保护力不断降低，免疫缺陷疾病病例不断增加，免疫缺陷的个体不能被BCG保护；而且，BCG免疫容易受环境中分支杆菌的影响导致失败。因此，改进BCG或研制更为安全高效的新型结核病疫苗是世界各国着重研究的热点。Ag85复合物主要包括Ag85A、Ag85B和Ag85C，是结核分支杆菌早期的细胞外分泌性抗原。其中，Ag85A组分是其中分泌率较高的，引起机体的细胞免疫应答较显著，是结核病亚单位疫苗的理想抗原研制；由ag85a构建的DNA疫苗可引发抗结核免疫应答，因此是D

5、NA疫苗的理想候选基因。近年来，ag85a以其优秀的免疫原性使得多种携带ag85a基因的结核疫苗已进入了临床试验研究，成效理想。乳酸菌(Lacticacidbacteria，LAB)隶属革兰氏阳性菌，是一类应用在食品中最广泛的工业菌株。乳酸菌与人类关系密切，一些是机体肠道内的正常菌群，对机体起着有益的作用。在食物腐败的防治、免疫力的提高以及风味的改善等方面乳酸菌起着重要作用。对乳酸菌分子结构、基因组成及其独特性质的研究不断深入，除食品工业外乳酸菌的应用领域也逐渐扩大。人们以乳酸菌为宿主菌，构建用于表达异源蛋白表达载体，取得了重大的研究进展。由于有些乳酸菌是人和动物肠道的正常菌群，食品

6、级安全乳酸菌载体可以递呈抗原分子，制成与肠道粘膜直接作用的口服疫苗，可取得良好的免疫效果。本研究通过PCR技术扩增了牛结核杆菌ag85a基因，并与pMD18-TSampleVector连接，构建了重组克隆质粒pMD18-T(S)-ag85a。通过限制性内切酶KpnⅠ和NcoⅠ酶切重组质粒pMD18-T(S)-ag85a和乳酸菌表达载体pNZ8149，将ag85a基因插入pNZ8149表达载体中，构建重组表达质粒pNZ8149-ag85a。将重组表达质粒pNZ8149-ag85a电转入宿主菌NZ3900构建重组乳酸菌，以获得携带了目的基因Ag85a的重组乳酸菌。经10ng/mLNisi

7、n诱导，SDS-PAGE分析表明基因成功表达分子质量约为31kDa的蛋白。将此重组乳酸菌饲喂小鼠，研究分析小鼠的免疫应答反应。为研究重组乳酸菌pNZ8149-ag85a/NZ3900作为牛结核病新型疫苗奠定了基础。关键词：牛结核分支杆菌，ag85a基因，重组乳酸菌，食品级筛选，免疫检测IAbstractBovinetuberculosisisazoonosiswhichthreatshumanhealthandhindersthedevelopmentof