猪流感病毒基质蛋白m2e与fc基因融合重组乳酸菌的制备及其免疫效果研究

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1、分类号：S858.2单位代码：10193密级：公开学号：2012640硕士学位论文猪流感病毒基质蛋白M2e与Fc基因融合重组乳酸菌的制备及其免疫效果研究PreparationandResearchofSwineInfluenzaVirusMatrixProteinM2eGeneFuseRecombinantLactobacillus作者姓名：王倩学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：动物微生态与粘膜免疫指导教师：王春凤教授杨桂连副教授所在学院：动物科学技术学院二〇一五年五月本研究由国家高技术研究发展计划(863计划

2、)(2011AA10A215，2013AA102806)和国家自然科学基金项目(31272541)资助。ThisworkwassupportedbygrantsfromChineseNationalHigh-techR&DProgram（863Program）(2011AA10A215,2013AA102806)andtheNationalNaturalScienceFoundationofChina(31272541).独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特

3、别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大

4、学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要猪流感(Swineinfluenza，SI)是全球范围内广为流行的动物传染

5、病之一，近几年来在我国各地发病较为常见，给我国的养殖业造成了十分重大的经济损失。研究表明乳酸菌能特异性表达外源目的蛋白，是一种极具应用潜力的多功能型微生态制剂。其特有的安全性、低成本和易培养等优点也昭示着它作为基因工程疫苗表达载体所具有的重要研究价值。本试验选用乳酸菌作为外源蛋白的递送载体，将猪流感病毒(Swineinfluenzavirus，SIV)主要保护性抗原M2e蛋白基因与小鼠的IgG的Fc受体片段基因融合在一起，将外源基因的特异性免疫及乳酸菌的益生功能集合于一身，研制Fc融合M2e基因的重组乳酸菌口服疫苗并对其免疫

6、效果进行初步检测及分析。研究内容及结果如下：（1）重组乳酸菌的构建、表达及免疫原性分析实验方法：通过合成、酶切、回收等方法制备包含融合基因的四组重组质粒，分别为质粒pSIP409、质粒pSIP409-3M2e、质粒pSIP409-3M2e-Fc（Fc未突变）、质粒pSIP409-3M2e-Fc（Fc已突变）。然后将重组质粒转化入大肠杆菌感受态中大量复制，采用双酶切等方法进行鉴定，运用电转化技术将重组质粒转入植物乳杆菌中并经诱导肽(SppIP)诱导获得表达，利用SDS-PAGE、Westernblotting进一步检测外源目的

7、基因在乳酸菌中的表达，结果显示重组蛋白pSIP409-3M2e、pSIP409-3M2e-Fc（Fc未突变）和pSIP409-3M2e-Fc（Fc已突变），以及所表达的蛋白均具有反应原性，为构建SIV重组乳酸菌口服制剂奠定基础。实验结果：通过上述方法成功制备重组乳酸菌，经酶切检验结果完全正确，且重组乳酸菌所表达的蛋白均具有反应原性，为进一步实验奠定了坚实的基础。（2）重组乳酸菌pSIP409-3M2e-Fc免疫保护效果的检测实验方法：将已成功制备的四组重组乳酸菌复苏，并加入诱导剂，诱导蛋白的表达，随后利用小鼠灌胃器通过灌胃的

8、方式对小鼠进行初次免疫和加强免疫。初次免疫时间为第1天、第3天、第5天，加强免疫时间为第26天、28天、第30天。加强免疫后一周左右通过流式细胞术检测各组小鼠肠系膜淋巴结和潘氏小结中CD95+PNA+的数量变化情况以及肠系膜淋巴结和潘氏小结中B220+IgA+的数量变化情况，这些指标指示着