甲型流感病毒m2e与ctb基因融合表达及其免疫特性初步研究

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1、甲型流感病毒M2e与CtB基因融合表达及其免疫特性初步研究：杨晓芳,江滟,李婉宜,邝玉,蒋忠华,王丰平,李明远【摘要】目的:构建真核表达重组质粒pcDNA3.1a(+)M2e/CtB,并初步研究其在NIH3T3细胞中的表达特性及免疫特性。方法:重叠PCR法扩增甲型流感病毒M2e基因和霍乱毒素CtB基因,将扩增得到的融合基因片段M2eCtB定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1a(+)中,再转化E.coliJM109。将酶切鉴定、PCR扩增及序列鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1a(+)M2e/CtB。用KEGENTRANSⅢ阳离子聚合物将重组质粒pcDNA3.1a

2、(+)M2e/CtB转染NIH3T3细胞,经免疫荧光、RTPCR产物序列分析、2e/CtB含完整的M2e和CtB基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%。重组质粒转染NIH3T3细胞后获得了有效表达,并且稳筛株细胞裂解物和上清均能用抗霍乱毒素抗体和抗流感病毒抗体检测到Mr约18000的蛋白条带。结论:成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1a(+)M2e/CtB,初步证明其在体外表达的重组蛋白可分泌至胞外,且有M2e和CTB的双特异反应原性和免疫原性,为流感病毒核酸疫苗的进一步研究奠定了坚实基础。【关键词】甲型流感病毒M2e黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚单位融合蛋白[A

3、bstract]AIM:ToconstructtheeukaryoticrebinantplasmidpcDNA3.1a(+)M2e/CtBmunityofrebinantproteinM2e/CTBinNIH3T3cells.METHODS:M2e/CtBgeneidpcDNA3.1a(+)M2e/CtB.ThepcDNA3.1a(+)M2e/CtBedcolonieser.TheproductofM2e/CtBgenemunofluorescence,RTPCRsequencing,and2e/CtBcontainscorrectM2eandCtBgene.Bla

4、stnresultsshoongenicityofM2eandCtBmunityandreactivitytobothantiM2eandantiCTB.TheMrofM2e/CTBproteinidpcDNA3.1a(+)M2e/CtBhasbeensuccessfullyconstructed.TheplasmidcanexpressthefusedproteinofM2eucousimmunoadjuvant;CTB;fusedprotein自1918年世界流感大流行以来,流感病毒仍持续对人类健康造成危害,对经济造成重大损失。流感疫苗一直是人们依赖的抗流感武器,但

5、遗憾的是现有疫苗多以当前流行的流感病毒为防疫对象,一旦流感病毒发生变异,这些疫苗也无济于事。因此研发一种能防治多株流感病毒的保护性疫苗迫在眉睫。流感病毒有3种膜蛋白,分别是血凝素(HA),神经氨酸酶(NA),基质蛋白(M2),其中仅HA和NA均易发生变异,而M2蛋白的胞外区(M2e)在流感病毒株间是高度保守的。霍乱毒素B亚单位(CTB)是目前研究发现的一种新型黏膜免疫佐剂,同时也是霍乱弧菌主要的保护性抗原。此研究正是基于M2e的保守特性,将M2e与CTB进行融合表达并研究此融合蛋白的表达特性和免疫学特性,为今后深入研究具有交叉保护作用的抗流感病毒的核酸疫苗打下坚实基础。1材料

6、和方法1.1材料含流感病毒H1N1(A/PR/8/34)M2e基因的质粒pcDNA3.1a(+)M2e由本室王丰平硕士构建,含CtB基因的质粒pET32a(+)CtB/ureI由本室王保宁博士构建;pcDNA3.1a(+)和E.coliJM109,NIH3T3细胞由本室保存。兔抗流感病毒多克隆抗体由本室制备;马抗霍乱毒素多克隆抗体由中国药品生物制品检定所提供。DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶,PCR试剂盒及RT试剂盒购自Fermentas公司;质粒小量提取试剂盒购自Omega公司;KEGENTRANSⅢ阳离子聚合物转染试剂购自南京凯基公司;FITC荧光标记的羊抗兔二抗

7、Ig和HRP标记的羊抗兔Ig、兔抗马Ig二抗购自博奥森公司;2e/CtB基因真核表达质粒的构建(1)M2e/CtB基因的体外扩增:根据pcDNA3.1a(+)M2和pET32a(+)CtB/ureI分别设计了两对引物M1、M2和C1、C2,扩增包括M2e和CtB基因(分别为72bp和375bp)完整的开放阅读框架。M2和C1的5′端含反向互补12bp连接肽序列。两对引物及包含的酶切位点和连接肽如下:M1为5′CTAAGCTTAACATGAGTCTTCTAACCGAG3′(HindⅢ),M2为5′