甲型流感病毒m2e与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

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1、甲型流感病毒M2e与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达作者：牟旭鹏韦安慧申茉函孔宁颜炜群【摘要】目的将甲型流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)基因与人血清白蛋白(HSA)基因融合,以构建高效分泌表达的毕赤酵母菌株。方法通过RTPCR扩增HSA基因,构建pPICZαHSA质粒，将人工合成的M2e序列与pPICZαHSA质粒分别经BstBI和KpnI酶切消化后连接，构建真核表达载体pPICZαHSA/M2e，线性化后电转化毕赤酵母X33。用PCR法筛选Zeocin抗性阳性的克隆,SDSPAGE和2e菌株。结果经RTP

2、CR法克隆的HSA基因序列与GenBank登录的cDNA序列一致，构建的pPICZαHSA/M2e真核表达载体,经电转化获得Zeocin抗性阳性的克隆。SDSPAGE和2e,分子量约为68kD。结论成功构建了分泌表达重组HSA/M2e融合蛋白的毕赤酵母菌株,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。【关键词】甲型流感病毒;M2e;血清白蛋白;毕赤酵母　　【Abstract】ObjectiveTofusethegeneofM2eplifiedbyRTPCRandtheplasmidofpPICZαHSAesitesofpPICZα

3、HSAandobtainedtheexpressionvectorpPICZαHSA/M2e.TherebinantvectoricDNAoftransformedX33andperformPCR.SDSPAGEand2蛋白是流感病毒主要的膜蛋白之一，由流感病毒基因组第7节段编码，长97个氨基酸，N末端24个氨基酸残基暴露在胞膜外，C端的54个氨基酸定位于胞浆中，中间19个氨基酸残基跨过脂质双分子层。研究发现M2蛋白的单克隆抗体具有在细胞培养中抑制病毒复制的功能〔1〕，进一步证明M2蛋白胞外功能区(extracellula

4、rdomainofM2protEIn，M2e)诱生的抗体同样具有保护性〔2〕。由于目前在人群中流行的所有甲型流感病毒，其M2e都未发现存在明显差异，认为M2e在流感病毒株间是高度保守的〔3〕。因此，M2e蛋白被认为是可刺激机体产生对不同流感变异株都具有交叉保护效果的保护性抗原。本研究旨在构建HSA/M2e的真核表达质粒，将M2e与HSA在毕赤酵母中进行融合表达，为进一步研究M2e蛋白疫苗的免疫效果，开发和应用具有交叉保护能力的长效广谱疫苗奠定基础。　　1材料与方法　　1.1主要材料和仪器表达载体pPICZα及毕赤酵母菌株X33购

5、自Invitrogen公司;TaqDNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶等购自TaKaRa公司;琼脂糖DNA回收试剂盒、质粒提取和纯化试剂盒以及大肠杆菌XL1Blue购自北京鼎国生物技术公司;引物由上海生物工程公司合成;小鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体购自博奥森公司,辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体购自北京鼎国生物技术公司。　　主要仪器：PCR仪、孵箱、摇床为Forma公司产品;电穿孔仪MicroPulser购自BIORAD公司;DNA测序仪为Beckman公司产品。　　1.2方法　　1.2.1总RNA的提取和RTPCR用

6、Trizol法从新鲜分离的胚胎肝组织中提取总RNA，采用逆转录试剂盒和设计的引物(上游引物：5′CAGGAATTCGGCACAATGAGTGGGT3′,下游引物：5′GCGCTCGAGGTAGATGTTATAAGCCT3′)，以RTPCR法扩增HSAcDNA片段。反应产物做1%琼脂糖凝胶电泳检测。　　1.2.2HSAcDNA的克隆及测序扩增的特异性片段进行回收和纯化后，连接于pMD18T载体上，将重组质粒pMD18THSA转化大肠杆菌XL1Blue，通过α互补的蓝白筛选挑选重组子。经酶切电泳鉴定后，选出重组质粒

7、进行测序。　　1.2.3pPICZαHSA载体的构建将测序正确的pMD18THSA重组质粒进行PCR(上游引物5′GCGTTCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCC3′含BstBI酶切位点;下游引物：5′GTCGGTACCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC3′含KpnI酶切位点)，PCR扩增产物与质粒pPICZα分别经BstBI和KpnI酶切消化，用T4DNA连接酶连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌XL1Blue，以含Zeocin(25μg/ml)的平板筛选转化子，提取质粒，限制酶切鉴定

8、重组质粒。　　1.2.4pPICZαHSA/M2e表达载体的构建将人工合成的M2e序列与pPICZαHSA质粒分别经Eco81I和KpnI酶消化并经1%琼脂糖凝胶电泳回收特异片段,用T4DNA连接酶连接。连接产物转化至大肠杆菌XL1Blue，