流感病毒包装表达之外源基因特性概述

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1、流感病毒包装表达之外源基因特性概述第一章引言1.1禽流感病毒概述禽流感病毒，是单股分节段负链RNA(SS-RNA)病毒(Perdueetal.，1997),属于正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒。从水禽中可以分离到(Fouchieretal.,2005;S8)和NA亚型（N10和Nil)(Tongetal2013)。禽流感病毒可分为三种，高致病力、低致病力和非致病力禽流感病毒(Organization，2000)。高致病性禽流感(HighlypathogenicAvianinfluenza，HPAI)是由H5和H7亚毒株引起的疾病，传染性强，病死率高，被

2、世界动物卫生组织列为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。可引起家禽全身性严重的病理损伤，致死率达75%以上。由于病毒传播具有受体特异性的限制，绝大多数禽流感病毒不会感染人类，但是通过病毒基因的变异，禽流感病毒能够在不同宿主间传播。1997年，在香港地区，H5N1高致病性禽流感病毒导致了多人感染及死亡，第一次证明了高致病性的禽流感可以直接感染人类。2003年底，亚洲许多国家暴发了H5N1高致病性禽流感，引起多人感染及死亡。目前我国正在流行H7N9禽流感，病毒基因来自东亚地区野鸟和中国上海、浙江、江苏鸡群的基因重配，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒。

3、根据农业部办公厅发布的《全国家禽H7N9流感根除计划(征求意见稿)》，从2013年我国出现首例人感染H7N9禽流感病例至2014年2月18日，已累计感染病例347例，死亡109例。禽流感病毒通过抗原漂移和快速重组来逃避免疫监视（SuiJ.，2009)，导致禽流感危害严重，不仅给养殖业带来了巨大的经济损失，也一定程度上威胁了人类的健康。1.2禽流感病毒结构和理化性质通过电镜观察，禽流感病毒大多数呈球形。AIV粒子结构（图1-1),分为三层，最外层为囊膜，来自宿主细胞的脂膜。囊膜下有形态不一的纤突，每个病毒粒子大约有500个，其中呈三聚体棒状结构的血凝素（

4、HA)占90%，其余的是神经氨酸酶（NA)呈四聚体蘑恭状（Murphyetal.，1999)。囊膜糖蛋白M2嵌合在囊膜内，呈四聚体。囊膜下主要为结构蛋白Ml，形成球形蛋白壳，包围流感病毒的8个单股负链的RNA分子。里层即裹在蛋白壳内的为核衣壳，它含核蛋白(NP)，三种多聚酶蛋白(PB1、PB2、PA)和病毒的单链RNA(Lambetal.，1993)。禽流感病毒对高温、紫外线敏感(FranklinRM,1959),动物的排泄物如襄便和鼻腔分泌物对病毒有保护作用，在4X：传染性可以保持30?35天CBeardCadin-Darbycaninekidney

5、(MDCK)细胞系HA2，由上海兽医研究所动物流感病毒病原生态学创新团队保存。pIRES-Renilla质粒、PCAGGS-optiE(徐大伟etal.，2012a)、PCAGGS-E(徐大伟etal.,2012b)、441-HA-PBD质粒、HlNl流感病毒A/PuertoRico/8/34反向遗传系统质粒，由上海兽医研究所动物流感病毒病原生态学创新团队保存。441-opti-HA质粒为英茂盛业公司合成。OPTIPRO?SFM(SerumFreeMedium,SFM)培养液购自Gibico公司；琼脂糖购自BIOix和超纯水购自东盛生物；氯仿购自上海实

6、验试剂公司；DAPI染色液、RIPA裂解液（中）购自威奥生物；预染蛋白Maker购自麦生物公司；抗劳光萍灭封片液购自碧云天公司。OPTI-MEM购自Invitrogen公司；TPCK-tiypsin购自Sigma公司；去内毒素小量抽提质粒试剂盒购自OMEGA公司；PficDNAPolymerase>LipofectamineTM2000、限制性内切酶BspQl、T4DNA连接酶购自NEB公司；DNA纯化回收试剂盒和小剂量质粒抽提试剂盒购自Axygen公司；异丙醇、无水乙醇、DEPC水购自生工生物；MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂（RRI)、DL20

7、00Marker、TrizolRNA提取液、lOmMdNTP、XhoK、Mel购自TaKaRa公司；..2.2方法首先在超净台内无菌操作，取菌液冻存管置于冰上，用挑菌环沾取少量与2ml的Amp培养液内，活化菌液，然后按照以下步骤提取PBD-PR8-HA质粒：12000rpm离心Imin,弃去上清，加入250ul的BufferS1,反复吹打裂解菌液，再加入250ul的BufferS2,轻轻混合均匀，待溶液透亮后，加入350ul的BufferS3,混合至有白色絮状物，12000rpm离心lOmin，小心吸取上清至有制备管的2mlEP管中，12000rpm离

8、心Imin，弃去滤液，加入500ul的BufferDCK-HA2细胞上的传代培养.......