牛病毒性腹泻病毒E-0E-2融合基因重组卡介苗构建

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1、畜牧与兽医2015年第47卷第10期·89·牛病毒性腹泻病毒E0－E2融合基因重组卡介苗的构建1111112*孙凡婷，张云，张妍，李晶，刘菲，刘杨，杜锐(1．吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118;2．吉林农业大学中药材学院/教育部动物生产及产品质量安全重点实验室/吉林省药用动物二级实验室，吉林长春130118)摘要:为了增强重组卡介苗对牛病毒性腹泻黏膜病的免疫效果，本研究将敲除疏水氨基酸及密码子优化的E0基因与去除了C末端的疏水序列E2截短基因采用重叠延伸PCＲ的方法进行融合后，将其分别与pMV261/pMV361载体连接，电转化至卡介苗中，

2、构建重组卡介苗。45℃热诱导重组卡介苗表达，对表达产物进行SDS－PAGE和Westernblotting分析。结果证明E0－E2融合基因在卡介苗中成功表达，目的蛋白大小为66.5ku，且具有反应原性。关键词:牛病毒性腹泻病毒;E0－E2融合基因;重组卡介苗中图分类号:S855.3文献标志码:A文章编号:0529－5130(2015)10－0089－04牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheavirus，因此在结核杆菌中可以更好发生密码子的结合与翻译［8－9］BVDV)为黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pesti-过程。Bur

3、lein等通过试验证明，在体外表达可virus)成员，是牛病毒性腹泻(BVD)的病原，其临提高表达效率的10%，且有免疫数据显示，密码子床表现为发热、腹泻怀孕母畜流产或产畸形胎、持续的优化在体内同样对表达效率有积极的影响。Masaru感染等［1－2］。反刍动物是该病毒的天然宿主，近年来［10］Kanekiyo等用密码子优化的方法构建rBCG－p24，［3］研究表明猪和其他动物也可感染该病毒，1946年研究结果表明优化密码子的rBCG蛋白表达量要高出Olafson等首次发现牛病毒性腹泻黏膜病以来，目前未优化rBCG的40多倍。E2蛋白为BVDV主要的保［4］

4、该病已成世界性分布。我国自80年代报道了在牛护性抗原蛋白，其免疫动物后产生的BVDV中和抗流产胎儿脾中首次分离出牛病毒性腹泻病毒后，全国体有效地保护了动物避免同源毒株的攻击［11］。目前，部分地区动物呈现了不同程度感染率的报道，吉林地国内外对构建两段基因融合的基因工程疫苗研究较［5］区的家养梅花鹿也分离出该病毒。BVD已在我国少，综合E0基因的保守性与E2基因的突变性和良好普遍存在，给我国的畜牧养殖业造成严重威胁，本病免疫原性等优点，本研究将C24V标准株的E0截短尚无有效的预防制剂。国外通常采用接种灭活疫苗、基因和changchun184株的E2截短基因

5、进行融合后构监测控制、排除持续感染动物和免疫耐受动物等措建重组卡介苗，同时对表达蛋白的免疫原性进行分施，对BVD进行防制。BVDV灭活疫苗和弱毒疫苗析，旨在为研究预防BVD的有效基因工程疫苗奠定虽然可以有效保护同源或者抗原差异较小的毒株，基础。但对抗原性不同的BVDV毒株，则无法完全保护。E0蛋白内有一段高度保守的结构域，可刺激机1材料与方法体产生中和牛病毒性腹泻病毒和猪瘟病毒(classical1.1菌种与载体［6］swinefevervirus，CSFV)的抗体，国内外学者通常质粒pGEM－T－E0、pGEM－T－E2、大肠杆菌表达该基因用于疾病诊断和

6、新型疫苗研制。严伟JM109菌株由吉林农业大学经济动物疾病实验室构建［7］行将BVDVE0基因连接到pET32a表达载体中，转并保存，卡介苗、pMV361与pMV261载体由吉林大化入大肠杆菌BL21中，表达出以包涵体形式存在的学张西臣教授惠赠。重组蛋白，通过Westernblotting分析证明该蛋白具有1.2主要试剂良好的反应原性。结核杆菌中GC含量高达65.9%，PyrobestTMDNAPolymerase、ExTaqTMDNA聚合酶、T4DNA连接酶、EcoＲⅠ和ClaⅠ及DNA收稿日期:2014－11－28;修回日期:2015－07－22基金项

7、目:国家自然科学基金(31372436);国家科技支撑计划Marker(购于TaKaＲa公司)，pGEM－T(购于Pro-(2011BAI03B02－1)mega公司)，质粒提取试剂盒、凝胶回收纯化试剂盒作者简介:孙凡婷(1990－)，女，硕士生(购于杭州维特洁生化技术有限公司)，牛BVDV阳*通信作者:杜锐，教授，主要从事经济动物疫病病原学方面的性血清(购于中国兽医药品监察所)，辣根过氧化物研究，E－mail:durui71@126.com酶标记的羊抗牛IgG(购于北京博奥森生物技术有限公司)。·90·AnimalHusbandry＆Veterinary

8、Medicine2015Vol.47No.101.3E0－E2融合