牛病毒性腹泻病毒的检测反转录聚合酶链反应法RTPCR编制说明

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1、广西地方标准《牛病毒性腹泻病毒的检测反转录聚合酶链反应法（RT-PCR）》（征求意见稿）编制说明1项目背景和意义牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是引起牛（水牛、黄牛和奶牛等）的病毒性腹泻疾病重要病原体，是导致集约化牛场严重亏损的重要原因。BVDV造成牛腹泻、生产性能下降、繁殖障碍、持续感染等，发病率为2%～50%，腹泻导致的黏膜病致死率几乎为100%，已经严重阻碍养牛业的发展，但目前我国对BVDV还没有很好的防控措施。在养牛业中这种病毒的感染常有发生，不但给它们之间的鉴别诊断和有效防治增加困难，也给养牛业造成了严重的经济损失。广西养牛业

2、发展十分迅速，拥有占全国第5位的牛存栏量，其中水牛存栏数达438万头，占全国水牛总数的１/５，居全国之首，世界第二位，但在检测和防治BVDV方面十分薄弱，由此给广西造成严重的经济损失。因此开展牛病毒性腹泻病毒快速检测技术的研究势在必行。快速准确地检测BVDV是有效防制该病的前提，而仅依靠临床症状和病理变化不能对该病确诊，传统的病原分离和血清学方法不仅操作繁琐费时，而且其特异性差、敏感性低，无法对BVDV感染进行快速准确地鉴别诊断，已不适应现代集约化养牛业发展的需要。PCR病原检测方法具有特异性强、敏感度高、诊断快速等传统诊断方法所无

3、法比拟的优点，在发达国家已被广泛应用于动物疫病的诊断中。广西兽医研究所在国际上率先研究建立的BVDVRT-PCR检测技术，其特异性强、敏感性高。既可以对分离培养物的BVDVRNA进行检测,也可以对直接从临床样品中取样抽提的BVDVRNA进行检测，而且整个操作过程不超过8小时。为了使这一先进的病原检测技术能更好地为生产服务，特制定本技术操作标准。这一标准的制定，对现代养牛业中BVDV的有效防制及海关检疫都将具有十分重要的实用意义。2项目来源本标准是根据广西壮族自治区质量技术监督局下达文件《关于下达2010年第二批广西地方标准制订项目的

4、通知》（桂质监函[2010]342号）附件的编写任务通知，由广西壮族自治区兽医研究所承担。广西兽医所内“牛病毒性腹泻病毒的检测反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)操作规程”编写小组，按《中华人民共和国国家标准GB/T1.12000标准化工作导则》第1部分“标准的结构和编写规则”的要求组织编写的。计划于2011年完成。3编制过程为了方便广大使用人员，满足我区养牛生产发展需要，进一步加强动物检疫手段标准化，顺应我国加入WTO后与国际接轨的形势。现在有关部门的大力支持下，由广西壮族自治区水产畜牧局提出，广西壮族自治区兽医研究所按照标准研制

5、要求和编写工作的程序，及时组成了由单位专家和专业技术人员参加的编写小组，制定了编写方案，并就编写工作进行了任务分工。编制小组根据任务分工进行了资料收集和调查研究工作。一方面，去南宁、柳州、来宾等广西养牛业发展较快的地区及相关牛场企业进行考察和调研，实地进行检疫，了解BVDV的发病症状，传播途径等流行病学调查。二是查阅相关聚合酶链式反应法的技术要领，分析BVDV保守序列5’端非编码区，并设计引物，上网比对，制定BVDVRT-PCR标准操作规程。广西壮族自治区兽医研究所组织编写，力争通过广泛征求国内有关大专院校、研究所著名专家、学者的意

6、见后，形成推荐性地方标准。科学是迅速发展的，本规程也必将随着科技进步和生产水平的提高不断修改补充。由于时间仓促，水平有限，不妥及不足之处在所难免，恳请各位专家、学者提出宝贵的修改意见。4标准的编制原则及标准项目和主要技术内容4.1编制原则本标准的编制主要遵循以下原则：一是科学性原则。在尊重科学、亲身实践、调查研究及广泛征求意见的基础上，根据BVDV保守序列5’端非编码区，并设计引物，上网比对，制定BVDVRT-PCR标准操作规程。。二是可操作性原则。本标准无论是从样品采集，处理，RNA抽提，均操作简单，仅需8小时既可完成。实验仪器仅

7、需一台PCR仪和离心机。具有可操作性和实用性。三是协调性原则。以切实提高我区养牛业过程中病腹泻病防治的技术水平为核心，符合我国现行有关法律、法规和相关的标准要求。4.2主要技术内容本标准根据广西壮族自治区兽医研究所《反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和核酸探针检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的研究》项目所取得的成果，针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的5’端非编码区保守序列，设计了一对特异性引物，优化建立可以快速检测BVDV的RT-PCR，并对其特异性和敏感性进行了测定。结果表明，该RT-PCR可检测出不同基因型的BVDV，而对其它牛

8、病病原的检测结果为阴性；其最低可检测出1pg的BVDVRNA。5本规程的一些有关说明本规程在“4操作方法”的“4.1待检样品的准备”中给出了3种不同材料的准备方法。其中：4.1.1和4.1.2给出了从临床样品直接取样进行病原核酸抽提的