逆转录聚合酶链反应法检测消瘤保肺丸对Ecad、αcatenin及βcatenin表达的影响

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1、逆转录-聚合酶链反应法检测消瘤保肺丸对E-cad、α-catenin及β-catenin表达的影响【摘要】目的研究消瘤保肺丸对人肺癌PG细胞中E-cad、α-catenin及β-catenin表达的影响。方法采用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测E-cad、α-catenin及β-catenin表达的情况。随机分为四组，即消瘤保肺丸高剂量组、消瘤保肺丸低剂量组、对照组及空白组，分析电泳凝胶的灰度值。结果消瘤保肺丸高剂量组对3种分子的表达与空白组差异显著，(P<0.01)。消瘤保肺丸低剂量组α-

2、catenin、β-catenin表达与空白组差异显著，(P<0.05);E-cad表达与空白组无显著差异，(P>0.05)。在α-catenin的表达与空白组差异显著，(P<0.05)。结论消瘤保肺丸对人肺癌PG细胞的E-cad、α-catenin及β-catenin的表达有明显影响，消瘤保肺丸对肺癌有一定的抑制作用，该实验为今后分子水平的进一步研究提供了依据。【关键词】逆转录-聚合酶链反应;消瘤保肺丸;E-cad、α-catenin及β-catenin;人肺癌PG细胞　上皮细胞钙粘蛋白

3、(E-cadherin)是维持上皮细胞形态及同种细胞间粘附连接的主要粘附分子。α-连接素(α-catenin)是E-cadherin连接细胞骨架所必需的成分，E-cadherin借助于α5-catenin连接在E-cadherin与β-catenin之间[1]。大量的实验证实E-cad/catenins复合物介导细胞同质粘附而具有抑制肿瘤侵袭、转移的作用[2]。消瘤保肺丸中成药制剂，在临床用于肺癌已有多年，本篇通过PCR等相关手段研究消瘤保肺丸对E-cadherin、α-catenin及β-catenin表

4、达水平的影响，以探究中药抗癌转移的作用机制。　　1材料与仪器　　1.1药物消瘤保肺丸，仪器由河南省中医院院内制剂室提供，批号：20070514;清肺化痰丸，昆明中药厂有限公司，国药准字Z53020763，批号：080119。　　1.2动物及瘤株PG细胞(即人高转移性巨细胞肺癌细胞株)，由北京广安门医院提供;日本大耳白兔8只，购于郑州大学动物实验中心，动物合格证号：8cxk(豫)2005-2002。　　1.3试剂RPMI-1640培养基，美国Gibco公司，编号1313945;优级胎牛血清，天津TBD公司，编

5、号Df-1055;PCR试剂盒，北京Promega公司，编号m-7501;RTFsk-100试剂盒，日本Toyoto公司，编号76660C3;TrizolReagent，美国Gibco公司，编号1373341;DEPC原液，Sanland-ChemInternationalInc，0532B73;Goldview染色剂，北京赛百盛公司，编号Jun-04-2010。5　　1.4仪器二氧化碳培养箱HF90型，上海力新HEALFORCE;图像记录分析系统，大连Jim-XScientific，编号D140;PCRG

6、eneAmpSystem，美国AppliedBiosystems，编号2700;电泳仪，北京市六一仪器厂，编号DYY-6C。　　2方法　　2.1动物分组与模型建立　　2.1.1动物分组8只健康日本大耳白兔，随机分为消瘤保肺丸高剂量药物组、低剂量药物组，清肺化痰丸对照组，空白组4组，每组2只，每组每天早晚各给药1次，10ml/kg/次，其中高、低剂量组分别相当于人等效剂量的10，5倍，空白组给以等量生理盐水，连续给药3d。　　2.1.2动物模型建立空白组(每组每天早晚各灌胃生理盐水1次，10ml/kg/次);

7、对照组(每组每天早晚各灌胃1次，清肺化痰丸1g/kg);消瘤保肺丸高剂量组(每组每天早晚各灌胃1次，共消瘤保肺丸1.5g/kg);消瘤保肺丸低剂量组(每组每天早晚各灌胃1次，共消瘤保肺丸3g/kg)。5　　2.2药物制备实验用药剂量参考药物说明书。清肺化痰丸：实验时以纯净水配制成10%的浓度供试;消瘤保肺丸：实验时以纯净水配制成10%的浓度供试。　　2.3细胞培养复苏PG冻存细胞，培养基选用含20%优级胎牛血清的RPMI-1640培养基，隔日或每日换液1次，直至基本贴满下壁，细胞传代，每培养瓶中加2ml0.

8、25%胰蛋白酶液使细胞脱壁，加入8ml培养基，反复吹打后分入5ml至新培养瓶。观察细胞生长状态良好，分别加入各组含药培养基，放37℃CO2培养箱培养48h。　　2.4引物设计特异性引物(E-cad、α-catenin、β-catenin)，采用“PremierPrimer5”软件，由北京赛百盛生物技术公司制作。　　2.5RNA提取观察细胞基本贴满，PBS缓冲液冲洗3次，每次5ml;加入TrizolReagent1