tem116型esbl天然酶与重组酶的动力学特性研究(1)

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1、TEM116型ESBL天然酶与重组酶的动力学特性研究(1)　　作者：曾贤铭陈秀枢王震吕建新楼永良孙长贵陆永绥　　【摘要】目的研究TEM116型ESBL天然酶与重组酶的动力学特性，并比较它们的差异。方法采用紫外分光光度法检测酶促抗生素水解反应，以LeeWilson改良双倒数方程数据处理法进行数据处理，测定天然酶与重组酶的Km、Vmax及kcat。观察温度和pH对酶促反应的影响。结果以LeeWilson改良双倒数方程数据处理法进行数据处理方便而准确地测定了天然酶与重组酶的Km与Vmax并计算出kcat。温度和pH对天然酶与重组

2、酶酶促反应效应相似。天然酶与重组酶最优先的底物均为头孢哌酮，其次是头孢氨苄；对氨苄西林、阿莫西林、青霉素和哌拉西林有最高的催化效率。结论天然酶与重组酶的动力学参数无显著差异。　　【关键词】动力学β内酰胺酶重组蛋白β内酰胺类抗生素　　KineticcharacteristicsofnativeandrecombinantTEM116betalactamases　　ABSTRACTObjectiveToinvestigateandcomparethekineticcharacteristicsofnativeandrecombin

3、antTEM116betalactamases.MethodsHydrolysisreactionsofbetalactamantibioticsweredetectedbyultravioletphotometry.DatawasprocessedaccordingtoLeeandWilson′simproveddoublereciprocalequation.KineticparametersofnativeandrecombinantTEM116betalactamases,includingKm,Vmaxand

4、kcat,weredetermined.EffectsoftemperatureandpHonenzymaticreactionwereobserved.ResultsMichaelesconstantandmaximalvelocitywereobtainedbymeansofLeeandWilson′simproveddoublereciprocalequation,andthecatalyticconstantwascalculated.ThereweresimilarpH or temperatureeffectsone

5、ithernative or recombinantbetalactamases.ThemostpreferentialsubstrateforbothnativeandrecombinantTEM116betalactamasesiscefoperazoneandfollowedbythenextcephalexin.Amongthehighestcatalyticefficiencyareampicillin,amoxicillin,penicillinandpiperacillin.ConclusionThereisn

6、odifferenceofkineticcharacteristicsbetweennativeandrecombinantTEM116betalactamases.　　KEYWORDSKinetics;Betalactamases;Recombinantproteins;Betalactamantibiotics　　ESBLs的产生机制是细菌在抗生素选择压力下，由TEM1或TEM2型酶的活性中心发生一个或数个位点的突变，导致底物谱的超广谱化［1］。XX年首先分离自Klebsiellapneumonia和Escheri

7、chiacoli临床株的TEM116型超广谱β内酰胺酶是病原菌产生的一种耐药酶，能够催化水解青霉素类、第一～三代头孢菌素等β内酰胺抗生素的内酰胺环，使之失去抗菌活性。TEM型ESBLs是在亚洲地区具有流行趋势的超广谱酶，与TEM1相比，它在第84位点由Ile置换Val，在184位点由Val置换Ala，由于这两个氨基酸位点的突变，导致它对青霉素类药物保持高催化效率的同时，还能够水解绝大部分的第一～三代头孢菌素［2，3］。该酶属于Bush功能分类2be群，Ambler结构分类A类［4，5］。　　基因水平的分子生物学特征和以底物

8、谱为基础的酶动力学特性是研究新型ESBLs的两个重要途径，也是新型β内酰胺药物开发和酶抑制剂研究的标志性参考指标［6，7］。由于高纯度酶的获取十分困难，我们认为以往大多以部分纯化或粗制酶为材料所进行的有关动力学研究结果在文献间的可比性和实际引用中