重组zen降解酶a4-prx的纯化、酶学特性和降解产物初步研究

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1、硕士学位论文重组ZEN降解酶A4-Prx的纯化、酶学特性和降解产物初步研究作者姓名钟凤学科专业食品质量与安全指导教师吴晖教授所在学院轻工与食品学院论文提交日期2015年6月Thepurification,enzymaticcharacteristics,anddegradationproductsofRecombinantZEN-degradingenzymeA4-PrxADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：ZhongFengSupervisor：Prof.WuHuiSouthChinaUniversityof

2、TechnologyGuangzhou,China分类号：TS201.3学校代号：10561学号：201220122170华南理工大学硕士学位论文重组ZEN降解酶A4‐Prx的纯化、酶学特性和降解产物初步研究国家自然科学基金资助项目(31201330);广东省科技攻关项目(20130000202）资助作者姓名：钟凤指导教师姓名、职称：吴晖教授申请学位级别：工学硕士学科专业名称：食品质量与安全研究方向：食品微生物论文提交日期：2015年6月11日论文答辩日期：2015年6月9日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：委员：华南理工大学学位论文原创性声

3、明明：所呈交的论文是本人在导_指导下独立贿研究所果。除’文中特别加以标注引励内容外，本论文不包含任已经发表或撰写_果作品。对本文_究做出重要贡法律綱。本人完全_本声明的作者签名：众賺摊叫日学位论文版权使用授权书孤六全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即••研九生在校攻位期丨Hj论文工作的知识产权单位属华南理r大学。有权保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允^论文被查丨3(除在保密期内的保密论文外）；学校可以公布学位论文的部或部分内容，可以允许采娜印、缩印或其它复制手段保存、汇编论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。本学位论文属于：密，在____年

4、解密后适用本授权书。保密，同意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协的单位浏览；同意将本人学位论文提交中国学术期刊(光盘版)电:^杂东出版和编入CNKI《中国知识资源总库》，传播学位论文的全部分(请在以上相应方框内打“V”）作者签名.•曰期:⑷1指导教师签名：日期2以‘0作者联系电话：电子邮箱：联系地址(含邮编):摘要玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN,ZEA）是一种具有二羟基苯甲酸内酯结构的真菌毒素，由镰刀属(Fusarium)真菌产生，主要存在于霉变的玉米、小麦等谷类作物中，具有生殖毒性、内分泌毒性和肝脏毒性，对家禽家畜危害明显，并威胁着人类的健康。相比物理

5、和化学去除ZEN毒素的方法，生物法脱毒效率高、特异性强，对食物的营养成分破坏少，反应产物无毒，对环境无污染，是目前生物毒素研究的热点。本实验室从土壤中分离出一株不动杆菌Acinetobactersp.SM04可将ZEN降解成极低雌激素毒性的产物，从其培养上清液中分离出一种过氧化物酶组分，并将其基因克隆表达到毕赤酵母宿主内，优化培养后可大量分泌表达该重组过氧化物酶A4-Prx。本论文致力于从该重组毕赤酵母的培养上清液中分离纯化得到过氧化物酶A4-Prx，研究其酶学特性，初步探索ZEN毒素被A4-Prx降解后的结构变化。本论文通过诱导培养重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K

6、-A4-Prx，从其培养上清液中采用一系列蛋白分离纯化手段得到重组过氧化物酶A4-Prx，研究结果表明先用60%硫酸铵沉淀，再用0.02MTris-HCl（pH8.0）进行凝胶过滤SephadexG-100柱洗脱，然后进行离子交换SephadexDEAE-52柱的梯度盐洗脱，三个步骤结合得到高纯度且具有生物活性的过氧化物酶A4-Prx，分子量为41kDa。监测纯化过程中的过氧化物酶酶活变化，得出最终纯化倍数为12倍，纯化效果良好。本论文对过氧化物酶A4-Prx进行了酶学特性研究，结果显示：反映体系中的pH和反应温度均对过氧化物酶A4-Prx的酶活有着显著影响，pH为9.0和温

7、度为60℃时A4-Prx的过氧化物酶酶活最高；当H2O2浓度低于20mmol/L时，A4-Prx的过氧化物酶酶活随着H2O2浓度的升高而升高，反应符合米氏方程一级反应动力学，但当H2O2浓度高于50mmol/L时，A4-Prx的过氧化物酶酶活开始下降，最大酶活反应速率Vmax等于204.1U，此时Km值为4.85mmol/L；苯酚和4-氨基安替吡啉两种底物的浓度升高时，过氧化氢的Km值降低，但Vmax基本不变；两种抑制剂中，EDTA对过氧化物酶A4-Prx的酶活抑制作用显著，EDTA浓度为10mmol/