印尼热泉菌产高温卡拉胶酶的分离纯化、酶学性质及其降解特性研究

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1、印尼热泉菌产高温卡拉胶酶的分离纯化、酶学性质及其降解特性研究学位论文完成Et期：2Q!垒生垒月2Q．旦指导教师签字：—二丢』乏址答辩委员会成员签字：仑立出垒绁青岛科技大学研究生学位论文印尼热泉菌产高温卡拉胶酶的分离纯化、酶学性质及其降解特性研究摘要本论文目的是从印尼热泉菌中筛选具有产卡拉胶酶活性的菌株，并对高活性菌株的发酵条件进行优化；纯化该热泉菌所产卡拉胶酶，系统研究其酶学性质；分析该酶的降解特性，阐明其降解产物及其类型，以期为卡拉胶酶和卡拉寡糖的工业化生产提供理论和技术支持。产卡拉胶酶热泉菌株的筛选。从印尼泥样中通过富集培养、稀释涂布及划线分离的方法获得了94株菌，其中14株具有卡拉胶

2、降解活性。并进一步通过平板划线与卢戈氏碘液染色相结合的方式，对这14株菌进行复筛，最终筛选出菌株Lc50．1的产酶活性最高，其活性为3．56U／mL。经过形态学观察及16SrDNA序列等分析，最终确定菌株Lc50．1为芽孢杆菌属(Bacillussp．)。菌株Bacillussp．Lc50．1产酶发酵条件的优化。分别以装液量、接种量、转速、温度、pH、碳源、氮源和金属离子作为单一变量进行单因素实验，筛选出对菌株的酶活具有显著影响的单因素的取值范围；用Design．Expert软件对所有单因素进行Plackett．Burman实验设计，筛选出影响菌株产酶活力的4个最主要因素：温度、碳源、氮源

3、和金属离子；用最陡爬坡实验逼近最大响应区域，再对这4种因素用Box．Behnken设计及响应面分析法进行回归分析。经过多次实验确定菌株Bacillussp．Lc50．1的最佳产酶条件为：500mL三角瓶装入200mL发酵培养基、摇床转速150r／min、接种量1％、pH7．0、培养温度47．5℃；最佳培养基组成为：蛋白胨0．25％、卡拉胶0．3％、KCl21．55mmol／L，优化后发酵上清液的酶活达到8．9U／mL，比优化前提高了1．5倍。菌株Lc50．1产卡拉胶酶的纯化。菌株Lc50．1进行液体发酵培养24h，离心去菌体得到发酵上清液；通过30％．80％硫酸铵分级沉淀获得粗酶，然后采用

4、Q．SepharoseFastFlow离子交换层析和SephacrylS-200HR凝胶过滤层析技术对粗酶进行分离纯化，纯化后的样品经SDS．PAGE电泳检测显示为单一条带，经计算确定此卡拉胶酶的分子量为38kDa。菌株Lc50．1所产卡拉胶酶的酶学性质研究。研究结果表明，该卡拉胶酶的最适pH范围为9．0左右，说明该酶在碱性环境中有助于该卡拉胶酶行使其生物学功能；最适反应温度为75℃，并且在30min之内仍可以保持其活性在20％以上，印尼热泉茵产高温卡拉胶酶的分离纯化、酶学性质及其降解特性研究具有较好的高温耐受性；当酶液中加入氯化铁和氯化镁时，卡拉胶酶活性丧失；酶液中加入EDTA、氯化锶、

5、氯化锰、氯化钾、氯化镉对卡拉胶酶的活性具有抑制作用；而酶液中加入氯化钴、氯化钙、氯化铜、氯化钠对卡拉胶酶的活性具有不同程度的增强作用，其中氯化钙、氯化铜的作用尤为显著使酶活分别提高了1．7倍和2．2倍；酶的专一性实验表明该酶对n卡拉胶的降解具有强烈的专一性，对1c．卡拉胶、I．卡拉胶、琼胶和褐藻胶没有水解作用。菌株Lc50．1所产卡拉胶酶的降解特性。采用薄层色谱对菌株Bacillussp．Lc50．1所产卡拉胶酶的降解特性进行研究，结果表明，降解产物主要是九．新卡拉二糖，与现已报道细菌的n卡拉胶酶的酶解产物有所不同，说明该卡拉胶酶一种新型卡拉胶酶。关键词：热泉菌；卡拉胶酶；培养优化；分离纯

6、化；酶学性质；降解特性II青岛科技大学硕士研究生学位论文PURIFICATION，ENZYMECHARACTERIZATIONANDHYDROIⅣZINGCHARACTERIZATIONOFATHERMOSTABLECARAGEENASEFROMAHOTSPRINGBACTERIUMABSTRACTThispaperaimsatscreeningbacteriastrainsproducingcarrageenase、析也hi曲activityfromhotspringbacteriumofIndonesi％optimizingthecultureconditions，purifyingt

7、heenzyme，studyingtheenzymaticproperties，andanalyzingthecarrageenanoligosaccharideafterdegradationbytheenzyme．Thisworkeffectivelyprovidestheoreticalandtechnologicalsupportforcommercialproductionofcarrageenanoligos