章鱼肠道产蛋白酶菌的分离鉴定及酶学特性研究

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1、IsolationandIdentil6icationofProtease—·ProducingBacteriafromTractofOctopusvulgarisandItsEnzymaticPropertiesThesi：submittedt011eslssut)mlttedtoQingdaoAgmulturalUnivemtyInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofEngineeringRenPei(CollegeofFoodScienceandEngineering)Supervisor：PiaoMeiziQingdao．

2、ChinaJune，2012独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：／＼红氏i斗时间：71012-年]月1日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意

3、青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：‘生石$时间：砂l游]月f日导师签名：＼，／工叼时间：如l游"／Jl『日蒿蓦嘉赢一f章鱼肠道产蛋白酶菌的分离鉴足页爵特性研究摘要采用水解透明圈和检测蛋白酶活力的方法，从章鱼肠道中分离出一株产蛋白酶的菌株，对菌株进行了形态观察、生理生化实验和16SrRNA全序列鉴定。研究了菌株的最适发酵条件，考察了碳源、氮源、发酵时间、发酵温度、起始pH值等因素对菌株产蛋白酶的影响。同时利用硫酸铵沉淀、离子交换层析等方法分离纯化出一种电泳级蛋白酶纯品，并对其酶学特性进行了研究。考察了蛋白

4、酶的分子量、最适作用温度、最适作用pH值、热稳定性、金属离子及抑制剂、酶促动力学等性质。并将菌株应用于发酵章鱼下脚料，经超滤、阴离子交换层析分离获得抗氧化多肽。结果显示：1．经分离筛选获得产蛋白酶活性最高的菌株Bacillussp．QDV-3，为革兰氏阳性菌，杆状，两端钝圆，有芽孢。菌落为乳白色、圆形、凸起、边缘整齐湿润的光滑型小菌落。生理生化和16SrRNA全序列鉴定其属于细菌，厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，与弯曲芽孢杆菌Bacillusflexus3xWMARB．5有99．2％的同源性。2．Bacillussp．QDV-3菌株在以果糖为碳源，蛋白胨为氮源，培养基初

5、始pH值8．0，培养温度30℃的条件下振荡培养3．5天时，所产蛋白酶活力最高，培养基中添加Mn2+和Ba2+对菌株产蛋白酶有促进作用，所产蛋白酶在SDS—PAGE电泳上显示至少有5种蛋白酶，分子量分别为32．4、43．3、61．6、96．6和124．2kDa，蛋白酶的最适作用温度为50～60℃，最适作用pH值为9．0—11．0，热稳定性及pH值稳定性均较好；Mn2+、Mg“对蛋白酶有一定的激活作用；金属蛋白酶抑制剂(EDTA)和丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)对蛋白酶均有显著抑制作用，说明粗酶液中既存在金属蛋白酶也存在丝氨酸蛋白酶。3．粗酶液经硫酸铵沉淀、CelluloseCM．52阳离子交换

6、层析、DEAE．SephadexA50阴离子交换层析3步分离纯化，纯化倍数为2．5，活性回收率为12．5％，获得电泳级纯蛋白酶QDV-E，该酶分子量为61．6kD，最适反应温度为40℃，属中温酶，最适反应pH值为9．0～9．5，为碱性蛋白酶，且在50℃下热稳定性较好。动力学常数Km为10mg／mL。考察了金属离子及蛋白酶抑制剂对蛋白酶活性的影响，其中Mn2+、M92+对其有激活作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂可以完全抑制该酶的活性，说明该酶可能是丝氨酸族蛋白酶。4．章鱼下脚料多肽经超滤和DEAE—Sephadex得2个活性组分FI和FIl，并对不同多肽浓度下F羟自由基和超氧阴离子自由基的活性进行了研

7、究。由基均有清除作用，且FI的清除作用均强于Fl卜A50阴离子交换层析分离获I和FlI的清除DPPH自由基、结果显示，FI和FlI对3种自多肽浓度为0．6mg／mL时Fl和FlI对羟自由基的清除率最高分别为60．1％和42．3％，IC50分别为0．4mg／mL，0．62mg／mL。关键词：产蛋白酶茵；鉴定；纯化；酶学特性；抗氧化肽；IsolationandIdentificationofProtease--P