蛋白酶产生菌细菌的分离与鉴定

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1、蛋白酶产生菌细菌的分离与鉴定蛋白酶产生菌细菌的分离与优化一、研究背景及进展蛋白酶己广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫牛条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用,如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋口酶、胰凝乳蛋口酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶,能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮

2、肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。二、实验方案1材料与方法1.1材料1.1.1菌株B1分离自污水河的土壤；B9为B1物理诱变后所得的菌株。1.1.2药品弹性蛋白、刚果红弹性蛋白Sigma公司产品。1.2培养基1.2.1细菌富集培养基(%W/V)蛋白1.0,酵母膏0.5,NaCI1.0,pH7.0,121°C灭菌20mino1.2.2初筛培养基(%W/V)弹性蛋白0.80,葡萄糖0.10,酵母膏0.10,K2HPO40.10,KH2PO40.05,MgSO4•7H2O0.01,pH7.0,115°CX®30mi

3、n。1.2.3发酵培养基(%W/V)干酪素3.00,葡萄糖4.00,玉米提取液0.1,K2HPO4,0.20,MgSO4・7H2O0.01,pH7.0,灭菌30mino1.3胞外弹性蛋白酶产生菌的筛选方法1.3.1细菌富集培养称取土样lg,加入细菌富集培养基中，送摇床培养，150r/min,37°C培养48h。同时做两个平行实验。1.3.2分离将富集土壤悬液按每级稀释10倍的次序得到10—3.10一4、10—5的系列稀释液，再依次分别从各稀释度试管中各吸取0.2ml稀释液，加到相应的培养皿内，用涂棒涂匀。每个稀释梯度

4、做两个平行试验，37°C培养箱倒置培养48h。1.3.3弹性蛋白平板初筛将得到的单菌落用牙签点到弹性蛋白平板上，送37°C培养箱培养48h,观察有无透明圈产生。选择细菌水解弹性蛋白所形成的透明圈直径与菌径之比较大的菌落进行诱变实验。1.4菌种鉴定方法根据《微牛物分类学》和微牛物菌种鉴定实验进行鉴定。1.5弹性蛋白酶活性测定方法采用Sachar⑸方法并参照我国现行药用弹性蛋白酶测定方法加以改进。该法以与染料偶联的不溶性底物经酶作用而溶解至水相，反应上清液的光密度反应底物被消化的程度。取10mg刚果红弹性蛋白・弹性蛋白溶

5、于lml水中，加lmlpH7.4,0.2mol/L的硼酸缓冲溶液，取lml适当稀释的酶液于37°C下振荡反应20min,加入pH6.0,0.7mol/L磷酸钠缓冲溶液2ml终止反应，过滤后収上清液测495nm处的光密度，以不加酶液和底物的反应系统为空白。在此反应条件下溶解lmg刚果红弹性蛋白・弹性蛋白底物，所需的酶量定义为一个弹性蛋白酶活性单位(U)。2结果与分析2.1菌株筛选2.1.1弹性蛋白平板筛选观察产生透明圈的菌落，选择有透明圈产生的菌落再点种到弹性蛋白平板上2.1.2菌株鉴定经模式种对照，多组实验结果均表明

6、属枯草芽抱杆菌。2.1.3对B1菌株进行物理诱变并且测定诱变前后的其酶活菌株的筛选：物理诱变后稀释涂布得到的单菌落转点到弹性蛋白选择性培养基平板上，培养48h,选择透明圈直径与菌径之比较大的菌落进行发酵条件的研究。根据结果选择B9进行下一步的研究。取发酵液lml加纯水稀释后用刚果红弹性蛋白■弹性蛋白测酶活吸光度(459nm)o原菌株酶活力：74.25U/ml；B9的酶活力：120.00U/mlo2.3菌株B9产生弹性蛋口酶的条件研究2.3.1不同碳源对产酶条件的影响在产酶发酵培养基中，以4%的接种量，40ml摇瓶装量

7、试验了浓度为4%的五种碳源，在摇床上培养24h后，测菌体生物量及酶活吸光度。2.3.2不同氮源对产酶条件的影响在蔗糖4.00g,玉米提取液0.20ml,K2HPO40.20g,MgSO4-7H2OO.Olg,pH7.0的发酵培养基，4%接种量，40ml摇瓶装量的条件下，分别加入3%的干酪素、蛋白腺、酵母膏、牛肉膏、豆饼粉作为氮源，在摇床上培养24h后，测菌体生物量及酶活。2.3.3碳源、氮源和生长因子的合适浓度对产酶的影响在上述最佳碳、氮源发酵培养基中，用蔗糖、干酪素和玉米提取液进行正交试验L9(33),以求得三者较

8、适浓度。2.3.4验证实验在蔗糖4.00g,干酪素3.00g,玉米提取液0.1ml,K2HPO40.20g,MgSO4•7H2OO.Olg,pH7.0的优化发酵培养基(g/100ml),4%接种量，40ml摇瓶装量条件下进行验证实验。测得的酶活力为：126.97U/mlo2.3.5接种量对产酶的影响在300ml的三角瓶中，装入40ml上述优化发