浅析HPV18型E2蛋白高表达对巨噬细胞凋亡及其分泌功能的影响

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1、浅析HPV18型E2蛋白高表达对巨噬细胞凋亡及其分泌功能的影响【摘要】　　目的:研究HPV1E2及其N端(TAD)、C端(DBD)与GFP融合蛋白瞬时高表达对巨噬细胞凋亡及分泌活性的影响,为进一步研究E2蛋白在HPV18致癌机制中的作用奠定实验基础。方法:通过PCR从现有真核表达载体pEGFPC1/E2上分别扩增出TAD、DBD基因片段,并构建真核表达载体pEGFPC1/TAD、pEGFPC1/DBD。将3种真核表达载体及pEGFPC1分别转染MΦ,用倒置荧光显微镜观察它们的表达与定位,并以抗GFP抗体为一抗作Westernbl

2、ot检测它们的表达。通过3种融合蛋白在MФ内的瞬时高表达,在转染4h后分别检测各组细胞培养基中TNFα和IL1β的含量,并收集MΦ经染色以及流式细胞术观察检测其凋亡。结果:GFPE2融合蛋白主要表达于细胞核,细胞质内也有表达,而GFPDBD融合蛋白仅表达于细胞核内,GFPTAD仅表达于细胞质。GFPE2、GFPTAD融合蛋白在MΦ内高表达后MΦ凋亡率上升,细胞因子TNFα和IL1β分泌量增加,且GFPTAD作用强于GFPE2。而EGFPDBD无此作用。结论:HPV1E2及其TAD与EGFP融合蛋白瞬时高表达可诱导

3、MΦ凋亡并上调其分泌细胞因子TNFα和IL1β。【关键词】人乳头瘤病毒18型E2蛋白巨噬细胞凋亡细胞因子[Abstract]AIM:TostudytheeffectoftheoverexpressionofGFPE2,GFPTAD(NextremitydomainofHPV1E2)andGFPDBD(CextremitydomainofHPV1E2)ontheapoptosisandsecretionofmacrophagesandtofurtherexplorethecontributionofEgenetotheute

4、rinecervixcancer.METHODS:TADorDBDgenewasamplifiedfrompEGFPC1/HPV1EbyPCRrespectivelyandthenclonedintopEGFPC1vector.AfterthetransfectionofrecombinantplasmidsorpEGFPC1intothemacrophages,thEirexpressionwasexaminedbyfluorescentmicroscopyandWesternblot.ThecytokinecontentofT

5、NFαorIL1βintheculturemediumwastestedquantitativelywithELISAkitrespectively.ThestainedmacrophageswereobservedandthEIrapoptosisratewastestedbyflowcytometry.RESULTS:Aftertransfectedintomacrophages,GFPEfusionproteinwasmainlylocatedincytoplasmawhileGFPDBDfusionproteinwasc

6、ompletelylocatedinnucleiandGFPTADfusionproteinwascompletelylocatedincytoplasma.TheoverexpressionofGFPEorGFPTADincreasedthelevelofTNFαandIL1βandupregulatetheapoptosisrateofmacrophages.Furthermore,theeffectofGFPTADwasobviousexceptonIL1βlevelbuttheoverexpressionofGFP

7、DBDdidnotshowthesameeffect.CONCLUSION:TheoverexpressionofGFPEorGFPTADfusionproteincaninducetheapoptosismacrophagesandupregulateTNFαorIL1βsecretionofmacrophages.[Keywords]HPV18;Eprotein;macrophage;apoptosis;cytokine人乳头瘤病毒高危型如HPV16、18等常引起重度不典型性增生,甚至恶性肿瘤[1]。HPV18是一种无包膜

8、的环状病毒,基因全长7900bp,早期基因区编码的E2蛋白由365个氨基酸组成,分为2个结构域:N端转录活化结构域,由20aa组成;C端DNA结合域,由80aa组成;中间是一个可变的铰链区,由7aa组成[2