bax蛋白稳定高表达肝癌细胞的建立及其凋亡

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1、Bax蛋白稳定高表达肝癌细胞的建立及其凋亡【关键词】基因转染关键词:bax基因;癌，肝细胞;基因转染;基因表达摘要:目的建立稳定高表达Bax蛋白的肝癌细胞.方法用脂质体介导的基因转染法分别将含人baxcDNA的pBK-bax和pBK-CMV空载体质粒导入人肝癌细胞系HCC-9204细胞中.经G-418筛选获得细胞克隆.ABC法和图像定量分析检测Bax蛋白在细胞中的表达情况.HE染色观察细胞形态学变化.TUNEL法检测细胞凋亡发生情况.结果转染后用G-418筛选2echanismofproapoptoticgenebaxintheapoptot

2、icprocessofhepatocellularcarcinoma（HCC），andtoestablishtheHCCcellsidofbacteriophagueexpression　vectorpBK-bax，anbaxcDNA，idsofpBK-baxandemptyvectorpBK-CMVethod.Thepositivecellclones，ptyvec-tor，munocytochemicalABCmethodandimage-quantitativeanalysis.Themorphologicalchangesofthec

3、ellsethod.RESULTSTheagarosegelelectrophoresisindicatedthat，thereent，ptyvector，age-quantitativeanalysisafterim-munocytochemicalstainingindicatedthat，thereptyvectororuntransfectedHCC-9204cells.Thereorphologicalchangesofapopto-sis，suchascellpyknosis，circled，denselystainedandbu

4、b-bling，insomepBK-baxtransfectedcells，anditsTUNELin-dexptyvectororuntransfected.CONCLU┐SIONBaxgenecouldbetransfectedintoHCC-9204cellssuccessfully，andtheHCCcellsthatcanexpressBaxproteinstablyandhighlycouldbeobtained.TheapoptoticrateofbaxgenetransfectedHCC-9204cellsincreasess

5、ignificantly.　　0引言　　Bax是目前细胞凋亡研究中较为热门的促凋亡基因，属于细胞凋亡相关基因bcl-2家族.在多数情况下转染bax基因不仅能够使细胞生长受到抑制，而且能够促进多种因素诱导的多种细胞的凋亡［1-4］.关于转染bax基因对原发性肝细胞癌（简称肝癌）细胞凋亡的影响及其作用机制尚未见报道.免疫细胞化学检测显示，HCC-9204是一株Bax蛋白表达相对较低的肝癌细胞系.我们用基因转染法把bax基因导入肝癌细胞系HCC-9204细胞中，建立稳定高表达Bax蛋白的肝癌细胞，并对其凋亡现象进行观察，为研究有关bax基因在肝癌细

6、胞凋亡调控中的作用奠定基础.　　1材料和方法　　1.1材料插有正向人baxcDNA（576bp）的pBK-bax噬菌粒表达载体菌种为本校免疫学教研室刘飞博士惠赠.pBK-CMV空载体质粒为上海第二医科大学司晓辉博士惠赠.人肝癌细胞系HCC-9204为本室建立，用含有150mL・L-1新生牛血清的RPMI1640培养液在50mL・L-1CO2条件下培养.INE和G-418为美国Gibco公司产品.鼠抗人Bax蛋白mAb为美国Oncogene公司产品.免疫组化ABC试剂盒为美国Vector公司产品.末端脱氧核苷酸转移酶

7、介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法凋亡检测试剂盒为德国BoehringerMannheim公司产品.　　1.2方法　　1.2.1pBK-bax载体的鉴定pBK-bax菌种经铺板活化后挑取单克隆菌株置于含卡那霉素的LB培养基中，37℃振摇12h.用INE将pBK-bax质粒转染入HCC-9204细胞，同时设转染pBK-CMV空载体质粒和不转染的HCC-9204细胞对照.3d后换用含有500mg・L-1G-418的新鲜培养液继续培养，2～3L・L-1乙醇固定15min.分别经3mL・L-1H2O2

8、和3mL・L-1TritonX-100处理后，加正常羊血清，37℃，30min.加鼠抗人BaxmAb，37℃，1h.加生物素化的羊抗鼠IgGmAb，3