bax蛋白稳定高表达肝癌细胞的建立及其凋亡论文

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1、Bax蛋白稳定高表达肝癌细胞的建立及其凋亡论文.freelechanismofproapoptoticgenebaxintheapoptoticprocessofhepatocellularcarcinoma（HCC），andtoestablishtheHCCcellsidofbacteriophagueexpressionvectorpBK-bax，anbaxcDNA，idsofpBK-baxandemptyvectorpBK-CMVethod.Thepositivecellclones，ptyvec-tor，munocyt

2、ochemicalABCmethodandimage-quantitativeanalysis.Themorphologicalchangesofthecellsethod.RESULTSTheagarosegelelectrophoresisindicatedthat，thereent，ptyvector，age-quantitativeanalysisafterim-munocytochemicalstainingindicatedthat，thereptyvectororuntransfectedHCC-9204cell

3、s.Thereorphologicalchangesofapopto-sis，suchascellpyknosis，circled，denselystainedandbub-bling，insomepBK-baxtransfectedcells，anditsTUNELin-dexptyvectororuntransfected.CONCLU┐SIONBaxgenecouldbetransfectedintoHCC-9204cellssuccessfully，andtheHCCcellsthatcanexpressBaxprot

4、einstablyandhighlycouldbeobtained.TheapoptoticrateofbaxgenetransfectedHCC-9204cellsincreasessignificantly.0引言Bax是目前细胞凋亡研究中较为热门的促凋亡基因，属于细胞凋亡相关基因bcl-2家族.在多数情况下转染bax基因不仅能够使细胞生长受到抑制，而且能够促进多种因素诱导的多种细胞的凋亡［1-4］.关于转染bax基因对原发性肝细胞癌（简称肝癌）细胞凋亡的影响及其作用机制尚未见报道.免疫细胞化学检测显示，HCC-9204是

5、一株Bax蛋白表达相对较低的肝癌细胞系.我们用基因转染法把bax基因导入肝癌细胞系HCC-9204细胞中，建立稳定高表达Bax蛋白的肝癌细胞，并对其凋亡现象进行观察，为研究有关bax基因在肝癌细胞凋亡调控中的作用奠定基础.1材料和方法1.1材料插有正向人baxcDNA（576bp）的pBK-bax噬菌粒表达载体菌种为本校免疫学教研室刘飞博士惠赠.pBK-CMV空载体质粒为上海第二医科大学司晓辉博士惠赠.人肝癌细胞系HCC-9204为本室建立，用含有150mLL-1新生牛血清的RPMI1640培养液在50mLL-1CO2条件下培

6、养.INE和G-418为美国Gibco公司产品.鼠抗人Bax蛋白mAb为美国Oncogene公司产品.免疫组化ABC试剂盒为美国Vector公司产品.末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法凋亡检测试剂盒为德国BoehringerMannheim公司产品.1.2方法1.2.1pBK-bax载体的鉴定pBK-bax菌种经铺板活化后挑取单克隆菌株置于含卡那霉素的LB培养基中，37℃振摇12h.用INE将pBK-bax质粒转染入HCC-9204细胞，同时设转染pBK-CMV空载体质粒和不转染的HCC-9204细

7、胞对照.3d后换用含有500mgL-1G-418的新鲜培养液继续培养，2～3LL-1乙醇固定15min.分别经3mLL-1H2O2和3mLL-1TritonX-100处理后，加正常羊血清，37℃，30min.加鼠抗人BaxmAb，37℃，1h.加生物素化的羊抗鼠IgGmAb，37℃，30min.加ABC复合物，37℃，30min.除加正常羊血清一步外，上述各步之间均用PBS洗.用新鲜配制的DAB显色10min.脱水，透明，封片;②图像分析:采用HPIAS-1000彩色病理图文分析系统中的免疫组化定量分析窗口.每张切片在显示器上

8、随机选取40×视野（向同一方向移动切片，不重复，不重叠），计数约500个细胞.由计算机给出所测单个细胞的吸光度（A）值.计算各例细胞的A值x±s.数据经两组均数的t检验.1.2.4细胞凋亡检测HE染色按常规方法进行.TUNEL法检测:①细胞爬片晾干并经40gL-1多聚甲醛固定