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1、氧化型低密度脂蛋白对骨髓内皮前体细胞增殖、凋亡及NO分泌功能的影响论文宗小娟，王海昌，周祥，程康【关键词】内皮祖细胞Effectofoxidizedlobonemarroarrobonemarrog/L;groupC,10mg/L;groupD,20mg/L)ediumtodetecttheeffectofoxLDLonEPCs.MTTassayultiplicationabilityofEPCs.Floetryeasuredinthecellculturemediumbynitratereductasemethodto
2、findtheinjuryofoxLDLoncellsandcellfunctions.RESULTS:paredotedtheapoptosisofEPCs（groupB,18.35±0.08;groupC,24.22±0.07;groupD,40.37±0.13）（n=6）,anddamagedtheNOsecretingfunctionofEPCs.TheseeffectsagetheNOsecretingfunctionandpromotetheapoptosisofthecells.Ithadbeenseent
3、hatEPCsaybesomerelationshipbetg/L，C组10mg/L，D组20mg/L）作用于EPCs，MTT法检测oxLDL对EPCs增殖能力的影响.freelg/L链霉素，小鼠flk1、山羊属CD133（SantaCruz，美国）、鼠CD31,FITC羊抗小鼠（IgG）、FITC羊抗兔（IgG）、罗丹明兔抗羊（IgG）（Zymed，美国），NO,TBA试剂盒（南京建成，中国），LDL（Sigma，美国），6孔培养板（Nunclon，丹麦）;EliteESP流式细胞仪(美国COULTER公司)，Olym
4、pusTokyoCK相差显微镜（奥林巴斯），DG3022A型酶联免疫检测仪（南京华东电子管厂），UV2450分光光度计（日本SHIMADZU公司），MRC1024激光共聚焦显微镜（美国BioRad公司）.1.2方法1.2.1猪骨髓单核细胞的分离30g/L浓度苯巴比妥1mL/kg麻醉后，左侧髂后棘局部常规消毒铺巾，20g/L利多卡因5mL局麻，沿髂后棘行骨穿，有落空感后接肝素化的20mL注射器用力抽吸.抽出的细胞悬液经等体积DMEM混合重悬后，小心叠加于等体积淋巴细胞分离液上，保持界面清晰，2000r/min,离心20mi
5、n，吸取中间云雾层细胞，5倍体积DMEM重悬，1500r/min,10min，洗涤两次.末次离心后，弃上清，加入含100mL/L胎牛血清的DMEM重悬.取微量细胞悬液与等体积2g/L台盼蓝染液混合，进行细胞活力计数，死细胞被染成蓝色，活细胞不着色，活细胞数占98%以上.细胞接种于培养瓶中，由于成纤维细胞贴壁较快，多于24h内贴壁，故取24h未贴壁细胞，经含100mL/L胎牛血清、VEGF（10μg/L）,bFGF（10μg/L）的全培养液重悬后接种培养；部分细胞接种于铺有盖玻片的24孔板中，细胞爬片48h后进行鉴定.1.
6、2.2氧化低密度脂蛋白的制备低密度脂蛋白（LDL）购于Sigma公司，经PBS溶解后，与灭菌的CuSO4溶液（5μmol/L）,37℃孵育24h.对照含200μmol/LEDTA无CuSO4同样条件孵育.孵育中止后，氧化的LDL加EDTA至终浓度0.6mmol/L中止氧化，在含200μmol/LEDTA的PBS溶液中透析24h.丙二醛的生成表明LDL被氧化，用TBA法检测丙二醛的生成.OxLDL中TBA浓度为（14.74±0.55）mmol/kg.1.2.3实验分组细胞80%长满后，2.5g/L胰蛋白酶消化，全培养液重悬
7、呈单细胞悬液后，接种于96孔板及24孔板.贴壁后，取对数生长期细胞分组：A组(对照组)加等量含200μmol/LEDTA的全培养液；B,C,D组分别给予含oxLDL浓度为5,10及20mg/L的全培养液，37℃50mL/LCO2孵箱孵育.96孔板细胞孵育24h后，每孔加MTT5g/L,37℃继续孵育4h，终止培养，弃去孔内培养液，每孔加入150μL的DMSO后振荡10min，酶联免疫检测仪，490nm波长测各孔A值.细胞培养24h后，各取100μL细胞培养液，用硝酸还原酶法测NO的分泌量，使用南京建成NO试剂盒，方法见说
8、明书；24孔板培养细胞在oxLDL作用72h后，2.5g/L胰蛋白酶（含2g/LEDTA）消化细胞中止后，送流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率.1.2.4细胞鉴定激光共聚焦：细胞爬片48h后，40g/L多聚甲醛固定30min后，PBS冲洗3次，干燥后分别按1∶75稀释flk1和CD133的一抗，及CD31和CD133的一
