稻瘟病菌变异菌株的aflp分析

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1、维普资讯http://www.cqvip.com菌物系统21(3)：Mycosystema稻瘟病菌变异菌株的AFLP分析何月秋1,2HeiLEUNG2Robe~S．ZEIGLER2唐文华(云南农业大学植物保护学院昆明650201：国际水稻研究所昆虫与植病系菲律宾马卡提市3127)P中国农业大学植物保护学院北京100094)摘要：利用94对AFLP引物对3个起始菌株和9个致病性变异菌株进行分析，其中49对引物可以区别出不同菌株类型，辨别变异菌株与其起始菌株的关系，以及起始菌株间的亲缘关系。9个变异菌株中5个菌株的条带数减少1～3条，4个菌株条带数没有明显变化。结

2、果还表明，致病性及其他特征变异似乎与条带数缺失多少相关联。关键词：起始菌株，变异菌株，DNA指纹，亲缘关系中图分类号：Q939．96文献标识码：A文章编号：1007—3515(2002)03—0363—0369扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)技术(Zabeau&Vos，1993：VosPtd，．，1995)自诞生以来，已被广泛地用于生物的基因组分析。如植物的抗病基因定位及染色体作图(Lieta1．，1998；Zimnoch．Guzowskaeta1．，2000；Meksemeta1．，199

3、5；Ro~peeta1．，1997；JinPta1．，1998；Baieta1．，19991，病原的亲缘关系分析(Jansseneta1．，1996；Bragardeta1．，1997；Clercetdz．1998：BaavenPtdz．，2000)。由于它对基因组的微小变化具有较好的分辩能力，因而它也被广泛地用于同一病原真菌的营养体亲和群(Cillierseteta1．，2000)及病菌的无毒基因与病菌的毒性分析(Pongam，Pta1．，1998；Zhong&Stefenson，2001)。水稻稻瘟病菌是一个较易于发生变异的病原群体(Kiyosawa，19

4、82)，常使一个新推广的抗病品种在种植3～5年后便失去抗性。关于病菌的变异机制，人们一般认为一地抗病品种丧失抗性是由于病菌的突变、漂移或无性重组。本文是利用AFLP技术对稻瘟病菌致病性变异菌株的基因组进行分析，试图找出变异菌株与其起始菌株间的关系及变异机制。1材料和方法1．1菌株9个稻瘟病菌Magnaporthegrisea变异菌株：HC0(3)PKT，MC1(3+4)57—9，LC1(4)142，LC1(4)57．4．LC1(4)122，RC1(4)141，RC1(4+5)141，LC1(5)142，LC1(5)57—4和3个起始菌株：92394，101⋯7

5、21．1，9248．6是按文献(何月秋等，2000)获得的。‘国家自然科学基金资助项目收原稿日期：2002．01．16，收修改稿日期：2002-04-08维普资讯http://www.cqvip.com364菌物系统21卷1．2菌丝培养和DNA提取采用作者改进的方法(He．2000)。1．3AFLP扩增1．3．1DNA的消化取各菌株的DNA0．5gg，以EcoRI和MseI(BiosciencesTechnologies公司产品)各5U配制成混合液，在37。C下过夜完全消化。1．3．2酶切片段的连接和扩增采用Zabeau等的AFLP手册(Zabeau，1993

6、)略作修改。引物和接头由德国EppendorfGmbH公司合成(表1)。选择性扩增的引物共用39条，其中EcoRI引物l6条，MseI引物23条(表2)，两组引物配成94对进行选择性扩增。具体步骤如下：1．DNA模板的制备：以EcoRI和MseI接头在T4DNA连接酶作用下连接到限制酶消化的DNA片段：2．非选择性的预扩增：以92Al8和93C35为引物，于25gl反应体系(引物各62．5ng，dNTP各185I．tM／L，10mM／LTris．HC1，25mM／LMgC1，2UTag酶，10ng模板DNA)和94oC30秒，60。C30秒，72oC60秒，3

7、0个循环，72。C2分钟的扩增循环进行扩增：3．选择性扩增：将预扩增的产物稀释15倍，两组选择性扩增引物随机配对，在下列扩增程序下进行扩增：94。C30秒，65。C30秒，72。C60秒，一个循环；94。C30秒，65。C30秒，72。C60秒，l1个循环，每个循环降低退火温度0．7。C；94。C30秒，56。C30秒，72。C60秒，24个循环，72oC7分钟。其他反应条件同预扩增。4．电泳分离DNA片段选择性扩增的DNA产物在1．5％琼脂糖凝胶上电泳检查，以确认扩增效果。在选择性扩增的产物中加入等量的变性染料(98％甲酰胺，10mmol／LEDTA(pH8

8、．0)，0．5％溴酚蓝，0．5％二甲苯