真菌性角膜炎常见致病菌株的AFLP指纹图谱分析

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1、河北医科大学硕士学位论文真菌性角膜炎常见致病菌株的AFLP指纹图谱分析姓名：李乃芳申请学位级别：硕士专业：皮肤病与性病学指导教师：王刚生2003.3.1一±查塑墨—————————————————————————————————————一一真菌性角膜炎常见致病菌株的AFLP指纹图谱分析摘要目的：真菌性角膜炎(Mycotickeratitis)或称角膜真菌病(keratomycosis)为眼科一种较常见疾病，该病早期I临床症状不典型，与细菌性角膜炎很难鉴别，故不容易早期确切诊断。近40多年来，真菌性角膜炎的发病率明显增加。其原因有：①角膜外伤后，外界真菌侵入而致病。②抗

2、生素的应用，扰乱了细菌和真菌的共生现象。③局部应用皮质类固醇激素，使角膜组织抵抗力下降，促使真菌在角膜内增殖而致病。④代谢药和免疫抑制剂的应用，使宿主抵抗力下降。⑤农药和化肥的应用，使泥土中真菌发生某些变化，致病力增强。其常见致病菌菌株为镰刀菌，继之为青霉菌和曲霉菌。本病进展较快，若病情未得到及时控制，可致角膜穿孔，眼内炎，终致失明。因此，真菌性角膜炎的早期诊断和治疗成为当前迫切需要解决的问题。而治疗的成功与否及视力的恢复则取决于早期、快速、正确的诊断。然而，至今尚无一种可用于早期诊断的实验室方法。目前常用的实验室方法有真菌刮片镜检和培养。刮片法常有lO％KOH湿片，

3、Acridineorange染色，乳酸棉酚兰染色(LPCB)，Gram染色，CFW(Caleofluorwhite)染色，而角膜刮片常会给病人带来一定的痛苦，真菌培养需时较长(约2周左右)，且有被污染的可能性。国外有人用共焦显微镜进行动物实验及临床观察，但据报道共焦显微镜良一一!盎垫墨—__—●——___‘_____●-_________。。。-_1。。。__。。。_—__。——’’———一一好故成像功能需要病人的密切配合，任何微小懿l受球运动都会使图像模糊，因此不逮会于』L塑、高度残疾秘角膜穿孔的病人。角膜活检可用予角膜刮片镜检和真菌培养均阴性的情况下，但因其具有创

4、伤性而使其应用受到限制。PCR方法具有敏感、特异而且快速的特点，自从其一诞生就深受入们的喜欢。雨其中AFLP被认为是迄今为止最有效的分子标记技术。AFLP是FCR鸯RFLP耱结会豹一种技术，其基本原理是对基因维DNA限制挂酶切片段的选择性扩增，使用双链人工接头与基因组DNA的酶切片段相连接做为扩增反应的模板。接头与接头捆邻的酶切片段的几个碱基序列作为弓f物的结合位点。理论上讲，不管所研究的基因缀DNA有多么复杂，用AFLP都可以检测出任何DNA之闯的多态性。墨葡，国蠢陈洪、朱立蕊等厢AFLP的方法对8种常见致病性念璩营梅建播绂图谱。作者耀PstI单酶切基因组烈吨A，用

5、两条AFLP弓

6、物扩增，续果8令菌种都得到了清晰的特异条带，且菌种间的攒纹图谱具有明显差异。进～步选择临床上最常见的自念球菌8株分别进行AFLP反应。结果显示自念珠菌种内各单株间存在DNA指纹图落翡差异，僵这种差异，j、予念珠菌种闻的差异，这一结果与李冬梅等人的RAID对叁念豫蓠分型静结采相符。Boekhout等人耀AFLP对地理分布、斑滂型、生态来源主均不同的两种新型隐球菌进行基因分型。证实了每一种薪型隐球菌都有3个AFLP基因型。并且两种菌中都有一个杂交种的基因型，作者认为该基因型的出现是由予抗真菌药物的痘雳，使新型隐球菌改变了其毒力及对抗真菌药物的易感性，从两其

7、遗传物质发生改交雨产生了新酶基因型。一一皇叁塑墨．———J_————_Ⅲ———_————_————_————___——__-—_————一Reyn鼬lopez-GE等人熏AFLP采检测双相真菌在双相转纯过程中DNA甲基化的不同。实骏表噢DNA甲基他在真菌中普遍存在。并且证明了真菌在不同形态形成时发生了不同的DNA甲基化。但国内外尚无人用此方法对镰刀菌进行基因分戮。基于此，、本实验收集真菌性角膜炎患者的真菡翻片镜裣及真菌培养均阳往酶标本，分离、培养得到镰了≥落进行AFLP指纹图谱分析。一方甏建立镰刀菌的AFLP反应体系，筛选出能产生稳定、瀵暇DNA姑型的弓l物，对镰刀菌

8、进行基因分型。另一方蕊试图找出可用于早期诊断真菌性角膜炎的实验室方法，为临床早期选择用药提供实验室依据。方法：从真菌性角膜炎患者痫变处分离的镰刀菌菸20株，包括藻病镰刀菌14株，串珠镰刀菌6株。将所有菌株分离、纯化、耋耨鉴定藤接转手强铃蘩培葬滚内。振荡培养7天，收集菌丝球，用CTAB法提取其DNA。经EcoRI和MseI双酶切(37℃，6小时)，酶切完成后16℃，连接3小时。然后进行预扩增和选择性扩增。扩增后的产物经6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染成像。结果；l。AFLP弓l镌的筛选：在建立AFLP分析技术体系基躺上，月20株镶刃蓠作材料，澍AFLP弓{