微载体立体培养腰椎间盘细胞蛋白多糖表达的研究

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1、万方数据万方数据失败的胎儿椎间盘髓核和纤维环组织，5例；成人退变椎间盘细胞组，椎间盘疾病手术病例术中切除组织，7例。分别进行单层培养和微载体立体培养。1．3腰椎问盘细胞分离及培养手术切取椎间盘组织，在离体30min内取回实验室。超净台中，组织用Hanks液冲洗净。胎儿椎间盘组织在显微镜下分离髓核和纤维环组织，成人退变椎间盘组织未进行分离。把组织剪成lmm3的碎块，37℃下以质量分数为0．25％的胰蛋白酶消化组织30min，37℃下用O．2％的胶原酶静置消化4h，消化物用4层无菌纱布过滤，过滤后的液体离心(1000r／min)5m

2、in，去除上清液。用HAMF—12／DMEM培养液冲洗，离心(1000r／min)5min，重复3次。计数板进行细胞计数。细胞分别接种于底面积为25cm2培养瓶中，加入含青霉素100u／rIlL、链霉素100u／mL的HAMF—12／DMEM+10％胎牛血清(FBs)培养液。成人椎间盘细胞按104／mL密度接种⋯。在37℃、体积分数为5％的cO：的培养箱中培养。每2～3d换液，按时用倒置相差显微镜进行观察、拍照。1．4椎间盘细胞微载体旋转立体培养微载体置于2％一5％的硅油中预湿。称取2．04g／100JIlL的微载体颗粒，分装袋

3、包装。按说明书安装旋转培养瓶。将微载体同旋转培养瓶进行环氧乙烷消毒。将微载体放人旋转培养瓶，加入足含青霉素100u／mL、链霉素100u／nlL的m砸F-12／DIⅥEM+10％胎牛血清(FBS)培养液100IIlL，置于慢速磁力搅拌器上，以10r／fnin的速度在37℃、体积分数为5％c02的培养箱中培养24h。将单层培养的对数生长期的细胞[21(密度为105／ⅡlL)接种于旋转培养瓶中。进行旋转培养48h后，将慢速磁力搅拌器的搅拌速度调整至30r／IIlin。培养约5d半量换液，取1lllL含细胞的微载体进行光镜观察、计数。

4、1．5蛋白多糖含量的检测取对数生长期的不同样本、不同培养方式的细胞【3J，置人6孔板进行培养，每孔加入反应细胞(1×105)，另加lmL培养液，空白对照组每孔加2mL培养液，在37℃、5％C02培养箱孵育，培养结束前24h，每孔加入20斗Ci／mL拍S-su№te，继续培养至120h，放置4℃冰箱终止渗入。各组培液移人透析带(12000一14000u)中透析72h，细胞刮下后冲洗、离心放人裂解液中4℃下孵育24h，培养液组不用裂解。将含有细胞外基质的液体放到22恤m的滤膜上，真空抽干【4】。用B液体闪烁计数器测定每杯样品的蛋白多

5、糖含量(cpm)。细胞分泌的蛋白多糖分2部分计量：一是检测细胞内的蛋白多糖含量，二是检测细胞外分泌的蛋白多糖含量，即培养液中的蛋白多糖含量。1．6数据处理所得的数据应用SPssV11．5统计学处理软件进行处理，所有数据进行方差分析及组间检验，P>O．05表示没有统计学意义，尹<0．05表示差异具有统计学意义，尸<0．0l表示差异具有显著统计学义。2结果2．1细胞内的蛋白多糖含量(见表1)2．2培养液中的蛋白多糖含量(见表2)3结论椎间盘组织工程学是骨科生物学研究中新的领域，基本原理和方法是将体外培养的高浓度种子细胞吸附扩增于一种

6、生物相容性良好并可被人体逐步降解吸收的生物材料上，形成细胞生物材料复合体。该生物材料为细胞提供一个生存的三维空间，使细胞能在按照预制设计的三维支架上生长，有利于细胞获得足够的营养物质并进行代谢。然后将此细胞生物材料复合体植入机体组织病损部位。移植细胞在生物支架逐步降解吸收过程中继续增殖并分泌基质，形成新的与自身功能和形态相近的组织和器官：这种具有生命力的活体组织能对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代∞’6J。种子细胞培养是椎间盘组织工程构建的起始和关键。目前在实验中运用多种特殊技术使得椎间盘细胞三维培养和单层培养

7、的对比研究变成可能。本研究发现成人退变椎问盘细胞微载体立体培养时，细胞在超微结构及表型上均与单层培养的椎间盘细胞基本一致，而随着细胞的传代类软骨细胞在形态方面发生去分化改变速度慢¨J，因此考虑成人退变椎间盘细胞微载体培养系统可作为椎间盘组织工程学研究中大量收集种子细胞的一种很好的模型。在此基础上本研究对微载体立体培养的细胞生物活性及分裂生长周期进行检测旧’3J，为选取合适生长周期的细胞进行蛋白多糖的含量监测提供依据，设计检测2种不同培养方式下处于对数生长期的椎间盘细胞蛋白多糖的表达情况。因为在椎间盘的基质主要由紧密排列的胶原和它

8、们之间大的蛋白多糖分子组成。蛋白多糖决定基质的细微空间结构【sJ，蛋白多糖的浓度越高，由糖胺多糖所决定的有效孔径就越小，而其有效孔径大小的分布对椎间盘水分的进出具有重要意义，所以对椎间盘细胞蛋白多糖含量的检测对2种培养方式的对比有较高的研究价值。万方数据登壁登登