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1、1230生物工程学报李泰明等/昆虫细胞制备AAV-ITR基因表达微载体ChineseJournalofBiotechnologyhttp://journals.im.ac.cn/cjbcnAugust25,2015,31(8):1230−1238DOI:10.13345/j.cjb.140485©2015ChinJBiotech,Allrightsreserved生物技术与方法昆虫细胞制备AAV-ITR基因表达微载体1122李泰明，潘俊杰，祁静，张春1中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京2100092中国科学院苏州生物医学工程技术研究所苏州市分子诊断和治疗技术重点实
2、验室，江苏苏州215163李泰明,潘俊杰,祁静,等.昆虫细胞制备AAV-ITR基因表达微载体.生物工程学报,2015,31(8):1230–1238.LiTM,PanJJ,QiJ,etal.PreparationofanovelAAV-ITRgeneexpressionminivectorinSf9insectcellsviabaculovirus.ChinJBiotech,2015,31(8):1230–1238.摘要:AAV-ITR基因表达微载体是只含有腺相关病毒(Adeno-associatedvirus,AAV)倒置末端重复序列(Invertedterminal
3、repeats,ITR)、基因表达顺式元件和目的基因，而不含有其他外源DNA序列的双链或单链DNA。本研究利用杆状病毒表达系统，制备得到两种重组杆状病毒Bac-ITR-EGFP和Bac-inrep，并将二者的P3代病毒共同感染昆虫细胞Spodopterafrugiperda(Sf9)，抽提小分子量DNA，获得7AAV-ITR-EGFP基因表达微载体，2×10的Sf9细胞抽提可以得到100μgAAV-ITR-EGFP基因表达微载体，核酸电泳显示AAV-ITR-EGFP基因表达微载体主要以单体和二聚体的形式存在。将AAV-ITR-EGFP基因表达微载体通过polyethyl
4、enimine(PEI)转染HEK293T细胞，24h后荧光显微镜观察有EGFP表达，48h后达到高峰，转化效率达到65%。关键词:基因治疗，基因表达微载体，杆状病毒表达系统，非病毒载体Received:September16,2014;Accepted:December1,2014Supportedby:NationalNaturalScienceFoundationofChina(No.81371670),GraduateTrainingInnovationProjectofJiangsuProvince(No.SJLX_0285).Correspondingaut
5、hor:ChunZhang.Tel:+86-512-69588327,E-mail:chunzhangspring@gmail.com.国家自然科学基金(No.81371670)，江苏省研究生培养创新工程(No.SJLX_0285)资助。网络出版时间：2015-01-14网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150114.1355.001.html李泰明等/昆虫细胞制备AAV-ITR基因表达微载体1231PreparationofanovelAAV-ITRgeneexpressionminivectorin
6、Sf9insectcellsviabaculovirus1122TaimingLi,JunjiePan,JingQi,andChunZhang1SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,Jiangsu,China2SuzhouInstituteofBiomedicalEngineeringandTechnology,ChineseAcademyofSciences,Suzhou215163,Jiangsu,ChinaAbstract:AAV-ITRgeneex
7、pressionminivectorisadouble-strandorsingle-strandDNAthatonlycontainsinvertedterminalrepeatsofadeno-associatedvirus,cis-elementsandgeneofinterestanddoesnotcontainanyotherforeignDNAsequences.WepreparedBac-ITR-EGFPandBac-inrep.SpodopterafrugiperdacellswereinfectedwithBac-ITR
