压力对体外培养下颌髁状突软骨细胞基质中蛋白多糖合成的影响

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万方数据第27卷第3S期2006年6月中山大学学报(医学科学版)JOURNAL0FSUNY^T．sENUNIVERSITYmEDICALscⅢNCEs)VoL27Nm3SJum2晰压力对体外培养下颌髁状突软骨细胞基质中蛋白多糖合成的影响郑卫平-。苏凯：，张志光：．郑有华，。葛成：．匡世军2(1．广东省^民医院口腔科．广东广州510060；2．中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院，广东广州510055)摘要：【目的l探讨机械压力对体外培养兔下颌髁状突软骨细胞基质中蛋白多糖合成的影响。【方法J羊叮甩白村压力装置对体外培养兔下领髁状突软骨细胞施以不同压力．收集细胞基质中的蛋内多糖。以硫醴咔唑法测定蛋白多糖代谢产物葡萄糖醛酸的古量，间接反映软骨细胞基质中蛋白多搪舍成变化情况。【结果】—n仿MPa组中葡萄糖醛酸音量高于其余各组(户℃0．05)。持续作用lOm洫后．葡萄糖醛酸古量最高；而nlMPa组葡萄糖醛酸古量低于其余各组ffk0．05)。【结论1．o．05MPB的压力持续作用10min．能促进兔下颌髁状突软骨细胞蛋白多糖的舍成代谢．可用于软骨组织工程种子细胞的培养。美鲁词：下颌屏状突软骨细胞；压力；蛋白多糖；组织工程中田分类号：R78文献标识码：A立章编号：1672—3554(2006)3S-0120—03近年来．软骨组织工程的兴起为软骨缺损的修复提供了新的希望．但是尽管软骨组织工程技术发展迅速．研究应用领域不断扩大．其仍然有许多问题有待解决。研究发现．在体内及体外非力学环境下构建的组织工程化软骨基质的组成和结构与正常软骨基质不同．其生物力学特性与正常软骨组织有着较大差距m。模拟体内生物力学环境．促进软骨化组织生物力学特性的改善，成为软骨组织工程研究的新方向闭。本研究通过观察不同压力条件下体外培养的下颂髁状突软骨细胞基质中蛋白多糖含量的变化情况，以探讨不同压力对软骨细胞体外合成蛋白多糖的影响。为寻找软骨组织工程种子细胞体外培养的适宜生物力学条件提供一定参考。l材料与方法1．1材料新生新西兰白兔9只(广州中医药大学实验动物中心提供)、DMEM培养基(高糖型，GIBcO)、1mg，LⅡ型胶原酵(Wo舳gL叫Bioch即正calCorP0mdon)、2．5mg几胰蛋白酶(GIBco)、2mg，L的术瓜蛋白酶、小牛血清(GmCO)、硼酸一硫酸溶液、lm异几咔唑液、葡萄糖醛酸标准溶液、6孔细胞培养板(conliIlg)、c02细胞培养箱(日本，s龃Y0)、循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、自行设计的加压装置(由密闭容器及压力表组成)、紫外分光光度计(UV—1601日本，SmMAnZU公司)。低温高速离心机(BjofupS№¨，Her"m)1．2方法按常规的机械+酶消化法分离获取原代兔下颌髁状突软骨细胞．将原代细胞传代后拄lxlO‰也细胞密度接种于25块6孔培养板中，置于恒温37℃、饱和湿度、体积分数5％C0：的细胞培养箱中培养。常规培养48h，待细胞大部分贴壁后，更换新鲜培养液(内古HEPs缓冲盐溶液)，随机将25块培养板分成不同压力的5组．每组5块。然后牧藕日期：2006_0蛳作者简介：郑卫平(1970一)．男．扛西新干人．磺士。主治医师进行不同压力条件下的培养。常压组(对照组)：将1组细胞培养板置于常压下(即l标准大气压下，本实验以l标准大气压为O)37℃温箱中培养。负压组：共2组．细胞培养板置人密闭容器中．严密封闭瓶体边缘．防止漏气．以橡胶管连接容器和真空泵．分别给予-0．05MP且和-0．1MPa负压。正压组：共2组．细胞培养板置人密闭容器中．以橡胶管连接容器、压力表及压缩气体瓶．打开压缩气体瓶阀门，待压力表到选相应刻度时，关用阀门，使容器内压力保持为0．05MPa和0．1Mh。给予压力后，将各组密闭容器置于37℃温箱中。各组中5块培养板分别于持续加压lmilI、5milI、10mi_l、30mill及lh后取出，置于常压下培养24h。以离心管收集培养液，在培养赦中加人50m异，L的氯化十六烷基吡啶7—8滴(10mL)培养液．然后将离心管置^高速离心机中离心15min(4000曲nin)将上清弃去，沉淀物留置备用。在细胞培养瓶中加入2mLPBS。I：!；后在光镜观察下．以细胞刮子将细胞刮下。保证细胞获取完全．将细胞悬液置于离心管中，离心15mi|l(4000dmh)。将细胞沉淀和培养液中基质沉淀合并，加人体积比为2：1的氧仿、甲醇溶液．振荡30mill．离心。上清液和沉淀物分别置于干燥器中干燥。将干燥后的脱脂干粉以2m以的术瓜蛋白酶5mL消化，置于67℃温箱中消化24h。将5一100叫mL葡萄糖醛酸标准液0．5mL置于试管中，各管中加入3mL砖却的硼酸一硫酸溶液，振荡混匀。在沸水中加热20min，取出后在玲水中冷却；加人0．2mLIm扎咔唑溶液，摇匀后在沸水浴中加热lOm_哪；室温下冷却15mjI．后．以盛有薰馏水的管为空白对照．测定其在530nm波长下的光吸收。然后以浓度对光吸收绘制葡萄糖醛酸标准曲线。另取O．5mL样品水溶液。按照上述相同的操作测定光吸收。根据下列公式得出每瓶糖醛酸的含量：m=A．×鸭／^。其中．^．为样品管光密度沮．为标准管光密度；鸭为标准 万方数据第3s期中山大学学报(医学科学腹】121管中葡萄培醛酸含量(斗g)。2结果各组别软骨细胞基质中葡萄糖醛酸的含量见表1。所有数据应用sPsslO．0统计软件进行方差分析。可知对照组中各加压持续时间(即培养板置于密闭容器的时间)耐软骨细胞基质中蛋白多糖吉量无明显影响(P>0．05)。各压力组软骨细胞基质中蛋白多糖含量与对照组相比有显著性差异(氏0．05)。-0．05MPa组中葡萄糖醛酸含量高于其余各组(P