免疫介导型再生障碍性贫血小鼠间充质干细胞成骨及成脂潜能改变.doc

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1、免疫介导型再生障碍性贫血小鼠间充质干细胞成骨及成脂潜能改变作者：高瑞兰尹利明钱煦岱林筱洁陈小红王潇【摘要】目的］探讨免疫介导型再生障碍性贫血小鼠间充质干细胞（msenchymalstemcell，MSC）向成骨及成脂肪细胞分化潜能的改变。［方法］采用免疫介导法进行再障造模，Babl/c小鼠经60Co射线亚致死剂量照射后，自尾静脉输入DBA/2小鼠的淋巴细胞建立免疫介导型再生障碍性贫血小鼠模型；造模15天后进行再生障碍性贫血小鼠骨髓间充质干细胞培养，并检测骨髓成纤维细胞集落形成单位（CFUF）数量变化，观察模型小鼠骨髓病理改变；茜素红和油红O分别检测模型小鼠MS

2、C钙结节数和脂肪细胞形成率。［结果］再障模型小鼠CFUF数明显减少；骨髓病理切片显示，造血组织减少，并脂肪化；再障小鼠MSC钙结节数量减少，脂肪细胞分化率显著增加。［结论］免疫介导再生障碍性贫血小鼠MSC成骨潜能减弱，成脂潜能明显增强。【关键词】再生障碍性贫血；骨髓间充质干细胞；成骨潜能；成脂潜能　　骨髓间充质干细胞是造血微环境的重要组成细胞，其生物特性的改变将影响骨髓造血，有研究表明再生障碍性贫血患儿MSC增殖能力弱于正常患儿［1］，但至今尚未见MSC与再生障碍性贫血发病机理的相关报道。因此，本研究通过探讨再生障碍性贫血模型小鼠骨髓MSC向成骨细胞以及脂肪细

3、胞分化潜能的改变，期望为进一步阐明再生障碍性贫血的发病机理提供一定的理论基础。1材料　　1.1动物Babl/c小鼠（18～22g，雌雄不限）50只，作为再生障碍性贫血模型（aplasticanemia，AA）载体。DBA/2小鼠（18～22g，雌雄不限）5只，作为再障模型免疫活性细胞供体（均由浙江中医药大学动物中心提供）。　　1.2主要试剂荧光素标记大鼠抗小鼠抗体：CD29PE，CD44PE，CD45FITC及相关同型对照抗体购于eBioscience公司（美国）。胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程公司。茜素红、油红O均购自Sigma（美国）。　　2

4、方法　　2.1骨髓间充质干细胞培养颈椎脱臼处死Babl/c小鼠，用75%的乙醇浸泡10min，无菌条件下取出双侧下肢骨，DMEM培养液冲骨髓，过4、6号针头制成单细胞悬液，1500转/分离心洗涤两次后，计数调整细胞浓度，用含10%胎牛血清、青霉素和链霉素各100U/ml的LDMEM培养液重悬，按照1×107细胞/cm2接种于培养皿中，并置于于37℃、5%CO2及饱和湿度的恒温箱中进行培养，72h首次换液，以后3至4天换液一次，当达到80%融合时用0.25%胰酶消化进行传代，根据所到细胞数按1∶1或1∶2进行传代纯化培养。以下实验均采用纯化的第4代贴壁细胞。4　

5、　2.2MSC表面抗原鉴定胰蛋白酶消化法收集上述贴壁细胞，分别与抗小鼠的CD29PE、CD44PE和CD45FITC抗体及相关同型对照室抗体温孵育15min后，PBS洗涤1次，流式细胞术检测贴壁细胞表面分子表达情况。实验重复3次，以确立骨髓间充质干细胞培养体系。　　2.3免疫介导再生障碍性贫血模型建立按照本研究室建立的方法［2］。先制备供体的胸腺和淋巴细胞悬液：DBA/2小鼠，颈椎脱臼处死，无菌取出胸腺及颈部、颌下、腋窝、腹股沟及肠系膜等处的淋巴结。置200目的不锈钢过滤网上，轻轻捣碎研磨，生理盐水冲洗，收集单细胞悬液。计数后，胎盘蓝拒染，活细胞>9

6、5%，调整细胞浓度至5×106/L。Babl/c小鼠经60Coγ射线（1.0Gy，5min）全身均匀照射后，于4h内自尾静脉输入供鼠的淋巴细胞106/只。　　2.4成骨细胞培养及鉴定取第4代MSC，接种于六孔板，2×105细胞/孔，当细胞贴壁生长达60％～70％融合时，吸去孔中培养液，加入成骨细胞诱导液（含LDMEM、10%FBS、10-8M/L地塞米松、10-2M/Lβ甘油磷酸钠、50mg/L抗坏血酸），每3d换一次液。培养2～3周后。去除培养液，PBS洗两次，95%乙醇固定10min，蒸馏水洗3次，加入0.1%茜素红，37℃染色30min，去除染液，蒸馏

7、水冲洗后，即在显微镜下观察钙结节。　　2.5成脂肪细胞培养及鉴定取第4代MSC，接种于六孔板，4×105细胞/孔，当细胞贴壁生长达80％融合时，吸去孔中培养液，加入成脂肪细胞诱导液（含LDMEM、10%FBS、0.25×10-6M/L地塞米松、50×10-6M/L吲哚美辛、0.5×10-3M/L3异丁基1甲基黄嘌呤、10×10-3g/L胰岛素）进行诱导培养，每3d换1次液。培养2～3周后，吸去培养液，PBS洗3遍，用10%甲醛固定细胞10min，蒸馏水漂洗，然后2%油红O染液室温染色20-30min，去除染液，PBS洗2次，苏木素复染后，显微镜下观察3个

8、不同视野并计数200个细