骨肉瘤诱导分化与多药耐药表型的生物学性状比较.doc

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1、骨肉瘤诱导分化与多药耐药表型的生物学性状比较作者：曾恒，陈安民，李锋，方煌，夏仁云【摘要】［目的］探讨诱导分化剂诱导骨肉瘤分化时同骨肉瘤耐药状态产生的分化情况的异同点，以便正确认识分化与耐药相关性。［方法］以诱导分化剂ATRA，IL4处理人成骨肉瘤细胞系，对比MG63耐药表型MG63/R，观察瘤细胞生物学性状。用原位杂交分析在这一转化过程上凋亡调控基因P53，bcl2mRNA表达，用Tunel法分析细胞的凋亡。MTT法检查细胞对药物敏感性。［结果］MG63/R，以及IL4，ATRA处理的MG63，细胞均出现分化，ATRA处理的MG63表现多药耐药性，并同MG

2、63/R表现出了相似的特性而IL4处理的细胞分化的同时并未出现耐药。［结论］肿瘤细胞分化的过程中有可能出现一种顽固的多药耐药的亚分化状态，这种差异性分化的产生可能同细胞种类、状态、药物作用特点及剂量有关，如何控制细胞向耐药状态的分化为肿瘤的治疗提出了新的难题。【关键词】骨肉瘤；多药耐药；分化；凋亡；P53；bcl2;ATRA;IL4　　传统观点认为骨肉瘤的耐药表型同骨肉瘤恶性程度成正相关，现在认为骨肉瘤耐药表型是一种相对分化的状态，其增殖能力、侵袭能力及转移能力较药敏肿瘤细胞呈明显下降。MDR/P170是经典的耐药途径，可使肿瘤细胞对多种结构和功能不相关的抗癌药产生耐药

3、性。而且可以通过多种彼此结构功能无任何相关性的药物诱导产生翻译和表达〔3〕。据认为分化诱导剂在治疗恶性肿瘤使其化分的过程中能产生多药耐药性。在诱导肿瘤细胞产生多药耐药性的过程中同时也出现了分化。这两种分化状态的细胞是否存在着相关性？　　本实验利用肿瘤细胞的诱导分化剂维甲酸和IL4分别诱导肿瘤细胞化〔8〕。比较观察维甲酸（ATRA）和IL4分别诱导的肿瘤细胞亚系同骨肉瘤的耐药表型之间在生物学上的异同点。　　1实验材料和方法　　1.1主要试剂和细胞　　人成骨肉瘤细胞系MG63（武汉大学中国典型培养生物馆藏中心）及其耐药表型MG63/R（由MG63经ADM间断冲击法诱导产

4、生）〔7〕，维甲酸（ATRA）为上海华联制药有限公司产品，人重组IL4购自晶美公司、足叶乙甙（VP16）北京制药厂、四甲基偶氮唑盐（MTT）华美生物工程公司、长春新碱（VCR）为上海化联制药有限公司、丝裂霉素C（MML）日本协和公司、鼠抗人Pgp（C219）单克隆抗体及地高辛标记的bcl2、P53的原位杂交试剂盒购自博士德公司。7　　1.2细胞培养条件　　细胞在37℃、5%CO2饱和湿度的CO2培养箱中培养，培养液为含10%的热灭活胎牛血清、青霉素100IU/ml和链霉素100μg/ml的完全DMEM细胞培养基。48h换液，细胞汇合时，用0.25%的胰蛋白酶/0.02%

5、EDTA（1∶1）消化传代。　　1.3诱导肿瘤细胞分化　　MG63（1×104/ml）细胞培养中分别加入ATRA（10-5mol/L）和IL-4(500U/ml)，连续培养5d后从形态学、生化代谢、瘤细胞增殖周期动力学方面评价细胞的性状。　　1.4Pgp检测Westenblot　　取上述药物处理后的细胞及MG63/R、MG63，提取细胞总蛋白制备样品〔5〕，并配置SDSPAGE凝胶，行SDSPAGE凝胶电泳，将蛋白质电转移和膜封闭，封闭结束后，加入用漂洗液稀释的抗Pgp抗体（购自晶美生物工程公司）（1∶500）封口，孵育过夜；加入用漂洗稀释的碱性磷酸酶标记的二抗

6、（1∶1000）大量TBS漂洗液洗膜3次，各10min避光用BCIP/NBT/Buffer（140ml∶80ml∶10ml）显色。图像经Uvpgrabitimagel软件采集，GelwordsIDAdvancedV4.01软件处理分析。　　1.5细胞周期及凋亡分析采用流式细胞PI染色法　　制备单细胞悬液［（4～7）×106/ml］用70%乙醇固定〔1〕，4℃保存，染色前用PBS进行离心沉淀去除固定液，加200μlRNaseA37℃水浴30min，再加入100μlPI染色液混匀，至4℃避光30min，上机测试，记录激发光488nm处红色荧光。　　1.6碱性磷酸酶活性的测定　　

7、细胞用胰酶消化后，重悬于10mmol/LTris·HCl（pH7.4）含1mmol/LKCl30mmol/LZnCl2,0.1%TritonX-100，超声破膜30s，后将处理后用4℃8000g离心后，用Lowry法检测ALP活性，并双宿脲法检测蛋白含量，单位为μmol/min/ngprotein。　　1.7肿瘤细胞药物敏感性的测定　　采用MTT生物活性检测法，所获结果用加权线性回归法计算各药物对肿瘤细胞的抑制浓度（IC50）。　　1.8P53和bcl2表达水平检测7　　采用原位杂交分别检测P53和b