ptdegfp△e250 mfoxp3融合蛋白的表达与穿膜能力鉴定

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1、PTDeGFP△E250mFoxp3融合蛋白的表达与穿膜能力鉴定作者：蔺昕宗扬勇许逊田雨香陈勋舒新军夏圣王胜军许化溪邵启祥【摘要】目的：构建、表达并纯化含有蛋白转导结构域（proteintransductiondomain，PTD）、eGFP的小鼠Foxp3突变体（PTDeGFP△E250mFoxp3）融合蛋白，为研究小鼠Foxp3的功能奠定基础。方法：利用重叠延伸PCR方法构建pET28aPTDeGFP△E250mFoxp3原核表达载体，并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达此融合蛋白，经Ni2

2、+柱纯化，通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察其穿膜效率。结果：成功构建了pET28aPTDeGFP△E250mFoxp3原核表达载体，并表达和纯化了PTDeGFP△E250mFoxp3融合蛋白，流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果显示融合蛋白能很好地穿过细胞膜进入细胞内，并定位于细胞质和细胞核。结论：成功制备了具有穿膜活性的PTDeGFP△E250mFoxp3融合蛋白，为更好地研究小鼠Foxp3的功能与特性奠定了实验基础。【关键词】蛋白质转导结构域；Foxp3；突变；穿细胞膜活性［Abstract］O

3、bjective:ToexpressandpurifyamutantmouseFoxp3fusionproteincontainingaproteintransduction16domainfromTATandanenhancedgreenfluorescenceprotein(PTDeGFP△E250mFoxp3),furthermoretoinvestigateits′sefficiencyandabilitytransmembraneandlaidthegroundworkforfutureresearch

4、aboutthefunctionofmousefoxp3.Methods：ThepET28aPTDeGFP△E250mFoxp3vectorwasconstructedbyinsertingthePCRproductsofmousemutantFoxp3intopET28aPTDeGFPvector.ThefusionproteinwasexpressedbyE.coliRosetta(DE3)andpurifiedbyBioRadProfinityIMACNichargedResin.Theeffic

5、iencyandabilityoftransmembraneofPTDeGFP△E250mFoxp3weredetectedbyFCMandconfirmedbyconfocalmicroscopy.Results：ThevectorofpET28aPTDeGFP△E250mFoxp3wasconstructedcorrectlyandthefusionproteinwasexpressedandpurifiedefficiently.TheresultsofFCMandconfocalmicroscopy

6、investigationindicatedthatPTDeGFP△E250mFoxp3fusionproteintransduceintoEL4cellefficiently.Conclusion：ThePTDeGFP△E250mFoxp3proteincantransduceintocellsefficientlyandmaybeausefultooltostudythebiologicalfunctionsofFoxp3.［Keywords］proteintransductiondomain；Foxp

7、3；mutant；transmembraneability16CD4+CD25hi调节性T细胞(regulatoryTcells，Treg)是一群具有免疫调节功能的成熟T细胞亚群，其通过抑制潜在的自身反应性CD4+CD25-T细胞，而在自身免疫耐受的形成、维持中发挥着重要的作用［1］。Foxp3(forkheadboxP3)属于Fox转录因子家族成员，2001年由Brunkow等首次报道［2］。2003年Rudensky,Ramsdel和Hori等研究小组均证明Foxp3特异性表达于CD4+CD25hiT细胞中，是T

8、reg细胞的标志性蛋白之一，且Foxp3很大程度上决定了Treg细胞的发育和功能［3-5］。小鼠Foxp3蛋白结构包括N末端富含脯氨酸的结构域，中间C2H2锌指结构和亮氨酸拉链，而叉头状DNA结合域靠近蛋白C末端［6］。在人类中研究显示约70%发生严重的性联多内分泌腺和肠病变（immunedysregulation,polyendocrinop