融合蛋白hsp70egfp的表达、纯化及其在树突

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1、融合蛋白HSP70EGFP的表达、纯化及其在树突【摘要】目的：研究树突状细胞（DCs）对热休克蛋白70（HSP70）融合蛋白的内化作用.方法：首先原核表达并分离纯化HSP70和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白HSP70EGFP.实验中所用DCs于人外周血.内化实验分3组进行：将1，2组DCs分别与融合蛋白HSP70EGFP和蛋白EGFP孵育30min；第3组先将DCs与HSP70孵育30min，再与HSP70EGFP孵育30min.之后将3组DCs转至37℃孵箱内，培养0.5，1，2和24h，应

2、用流式细胞仪检测含HSP70EGFP或EGFP的DCs数量.应用IL12Elispot法检测HSP70EGFP等抗原促进DCs分泌IL12的效果.结果：①成功获得了重组蛋白HSP70EGFP，Mr约为97000，HSP70EGFP表达量占总蛋白的35.7%.纯化后的融合蛋白HSP70EGFP溶液经紫外线灯照射时发出鲜绿色的荧光.②流式细胞仪检测结果显示在37℃孵育0.5h后，HSP70EGFP孵育的DCs组阳性率为63.3%，其余两组为阴性.在37℃孵育1，2和24h后，3组阳性率均大于80

3、.0%.IL12Elispot检测结果显示，在刺激DCs活化及分泌IL12的水平上，HSP70EGFP与脂多糖（LPS）之间的差别无统计学意义(P>0.05)，而HSP70EGFP的活化DCs能力明显高于EGFP(P=0.001).结论：①受体介导的吞噬作用在DCs内化HSP70EGFP的初始阶段起主要作用，随孵育时间的延续，吞饮作用占主要地位.②HSP70EGFP可促进DCs分泌特征性细胞因子IL12.【关键词】吞噬作用；受体介导；树突细胞；重组融合蛋白质类；热休克蛋白质70；绿色荧光

4、蛋白质类　　热休克蛋白家族在肿瘤免疫中发挥着免疫佐剂的功能，对开发肿瘤疫苗具有重要意义.许多研究采用标记的热休克蛋白观察HSP肽复合物在抗原递呈细胞（antigenpresentingcell,APC）上的呈递过程，发现APC表面存在HSP受体［1-2］.有研究发现，gp96融合蛋白与受体结合后，可以激活树突状细胞（dendriticcells，DCs）分泌IL12和TNFα，增强其抗原递呈能力［3］.而对热休克蛋白70（heatshockprotein,HSP70）融合蛋白在抗原递呈细胞上的递呈过程的

5、研究报道较少.我们设计了HSP70和具有示踪功能的增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP）的融合蛋白HSP70EGFP，以探讨DCs内化外源性抗原的方式及不同抗原对DCs的活化效果.　　1材料和方法　　1.1材料　　新鲜全血由健康志愿者提供；质粒pIRES2EGFP（美国Clontech公司）；原核表达载体pET28a(+)HSP70由第四军医大学病理学教研室陈广生博士构建；NiNTAHis.Bind树脂（美国Novagen公司产品）；rhIL

6、4，rhIL2（美国RD生物工程公司产品）；rhGMCSF由厦门特宝生物工程公司生产；鼠抗人McAbCD1a，CD80和HLADR（美国Sigma公司）；羊抗鼠IgGFITC（武汉生物制品公司）；人IL12Elispot系统（法国DIACLONE公司产品）；蛋白HSP70，MAGE1由第四军医大学病理学教研室惠赠；蛋白EGFP的制备按文献［3］的方法进行.　　1.2方法　　1.2.1载体的构建　　根据EGFP的基因序列，设计引物，用PCR技术从质粒pIRES2EGFP中扩增EGFP，上游引物为：

7、5′CCTGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3′，下游引物为：5′GCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG3′，分别包含了SacI和XhoI的内切酶位点(划线部分).将EGFP基因克隆到pET28a(+)HSP70原核表达载体上，与HSP70基因融合，转化E.coliDH5α宿主菌，挑取单克隆菌落，提取质粒进行酶切鉴定，酶切产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳.　　1.2.2融合蛋白的表达　　将重组质粒转化入E.coliBL21(DE3)，用卡那霉素筛选.培养含

8、有HSP70EGFP融合基因的BL21大肠杆菌至对数生长期，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，4℃诱导表达12~18h，收菌.SDSPAGE分析融合蛋白的表达.　　1.2.3HSP70EGFP融合蛋白的分离与纯化　　用50mmol/L磷酸缓冲液+300mmol/LNaCl，pH8.0，充分悬浮细菌，冰浴、超声裂解细菌，离心收集上清变性蛋白.用22μm滤膜过滤，Ni离子亲和层析柱层析，250