融合蛋白hsp70egfp的表达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用论文

《融合蛋白hsp70egfp的表达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、融合蛋白HSP70EGFP的表达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用论文【摘要】目的：研究树突状细胞（DCs）对热休克蛋白70（HSP70）融合蛋白的内化作用.方法：首先原核表达并分离纯化HSP70和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白HSP70EGFP.实验中所用DCs来源于人外周血.内化实验分3组进行：将1，2组DCs分别与融合蛋白HSP70EGFP和蛋白EGFP孵育30min；第3组先将DCs与HSP70孵育30min，再与HSP70EGFP孵育30min.之后将3组DCs转至37℃孵箱内，培养

2、0.5，1，2和24h，应用流式细胞仪检测含HSP70EGFP或EGFP的DCs数量.应用IL12Elispot法检测HSP70EGFP等抗原促进DCs分泌IL12的效果.结果：①成功获得了重组蛋白HSP70EGFP，Mr约为97000.freela公司）；羊抗鼠IgGFITC（武汉生物制品公司）；人IL12Elispot系统（法国DIACLONE公司产品）；蛋白HSP70，MAGE1由第四军医大学病理学教研室惠赠；蛋白EGFP的制备按文献［3］的方法进行.1.2方法1.2.1载体的构建根据EG

3、FP的基因序列，设计引物，用PCR技术从质粒pIRES2EGFP中扩增EGFP，上游引物为：5′CCTGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3′，下游引物为：5′GCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG3′，分别包含了SacI和XhoI的内切酶位点(划线部分).将EGFP基因克隆到pET28a(+)HSP70原核表达载体上，与HSP70基因融合，转化E.coliDH5α宿主菌，挑取单克隆菌落，提取质粒进行酶切鉴定，酶切产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳.1.2.2融

4、合蛋白的表达将重组质粒转化入E.coliBL21(DE3)，用卡那霉素筛选.培养含有HSP70EGFP融合基因的BL21大肠杆菌至对数生长期，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，4℃诱导表达12~18h，收菌.SDSPAGE分析融合蛋白的表达.1.2.3HSP70EGFP融合蛋白的分离与纯化用50mmol/L磷酸缓冲液+300mmol/LNaCl，pH8.0，充分悬浮细菌，冰浴、超声裂解细菌，离心收集上清变性蛋白.用22μm滤膜过滤，Ni离子亲和层析柱层析，250mmol/L咪唑溶液洗脱，收集洗脱峰.SD

5、SPAGE分析纯化蛋白.1.2.4树突状细胞的培养采用文献［4］的方法分离、诱导及分化外周血中的DCs.在培养的不同阶段收集悬浮细胞，在光镜下观察细胞的形态，用流式细胞仪检测DCs表型.1.2.5内化实验实验分为三组，每组含1×106DCs，孵育蛋白浓度为100mg/L.将1，2组DCs分别与EGFP和HSP70EGFP于4℃孵育30min；第3组DCs先与HSP70在4°C孵育30min，洗涤3遍，再将DCs与HSP70EGFP在4℃孵育30min.之后将三组DCs转至37℃，50mL/LCO2孵箱内，分

6、别培养0.5，1，2和24h.流式细胞仪检测胞内含EGFP的DCs数量，阴性对照组除孵育蛋白为MAGE1外，其余各项同1，2组.1.2.6Elispot检测用人IL12Elispot系统（HumanIL12Elispotsystem）检测活化成熟后释放IL12的DCs细胞频数.依刺激物不同，分别为：1mg/LLPS；95℃灭活10min的1mg/LLPS；10mg/LHSP70EGFP；10mg/LEGFP；无刺激物.实验分5组进行，每组设3个复孔，加入培养5～6d的1×105DCs作为效应细胞.El

7、ispot检测按照试剂盒使用说明进行.统计学处理：用SPSS12.0统计学软件进行方差分析，实验数据以x±s表示，P0.05认为差异有统计学意义.2结果2.1重组质粒pET28a(+)HSP70EGFP鉴定EGFP的PCR产物经10g/L琼脂糖电泳，在740bp处可见单一条带，与预期结果大小一致（图1）.重组质粒pET28a(+)HSP70EGFP用BamHI,SacI和XhoI酶切后，经10g/L琼脂糖电泳，可见被切下约740bp，1990bp和2730bp左右的单一条带，分别与EGFP,HSP70和HS

8、P70EGFP的编码基因大小一致（图2）.2.2融合蛋白的表达、纯化转化后BL21细菌经0.1mmol/LIPTG4℃诱导12~18h，其全菌蛋白SDSPAGE电泳结果见图3.薄层扫描分析结果显示，目的蛋白表达量在35％以上.镍离子亲和层析表明，用250mmol/L咪唑溶液可以洗脱出融合蛋白HSP70EGFP，目标蛋白纯度达到90.6％，纯化后的融合蛋白HSP70