原核表达的含ptdegfp不同分子质量融合蛋白穿膜能力的比较

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1、原核表达的含PTDeGFP不同分子质量融合蛋白穿膜能力的比较【关键词】蛋白转导结构域；穿膜效率；增强型绿色荧光蛋白；分子质量　　［Abstract］Objective:TojudgetheefficacyofthefusionproteinincludingproteintransductiondomainofHIVTATbymultibiotechnologyandtoobtainthemoreeffectivecellularuptakeproteinforthefurtherresearchofitsbiofunction.Methods：Theexpressiono

2、fthreefusionproteinstheinclusionbodies.Floetryanalysisandconfocalmicroscopeobservationembraneandhadnodifference.　　［Keyain;theefficacyoftransmembrane;prokaryoticexpression；greenfluorescenceprotein　　1988年Green和Frankel分别发现HIV1TAT蛋白能够穿过细胞膜［1,2］，随后的研究发现，TAT蛋白中的47～57(YGRKKRRQRRR)位氨基酸才是真正具有转导作用的区域

3、，被称为蛋白转导结构域(proteintransductiondomain，PTD)［3］。该区域能转导自身及与其融合的多肽、蛋白及DNA分子进入几乎所有组织和细胞，甚至血脑脊液屏障，转导效率高且对细胞无明显的损伤［4-6］。PTD的发现，在研究蛋白功能和治疗方面有重要作用。绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)相对分子质量为27ku，在395nm波长光的激发下可以发射出明亮的绿色荧光［7］，它的表达没有种属特异性，而且产生的荧光不需要辅助因子、底物或其他基因表达产物的协助，灵敏度高。GFP在活细胞、组织或器官中无需任何处理即可在荧光显微镜下直接

4、观察，加之动物体内不产生内源性GFP，因此成为活细胞理想的标记物［8］。增强型绿色荧光蛋白(eGFP)是GFP的突变体，在480nm波长的激发光下可以发射出比GFP亮35倍的绿色荧光［9］，作为报告蛋白，已经广泛应用于基础实验研究。我们利用本实验室现有的PTDeGFP载体，构建同一个目的蛋白的全长和其不同结构域（即片段1和片段2）的表达质粒，在大肠埃希菌中表达，得到3种纯化的蛋白，研究PTDeGFP携带的3种不同分子质量融合蛋白的穿膜效率和能力。　　1材料和方法　　1.1材料　　pET28aPTDeGFP目的蛋白，pET28aPTDeGFP片段1，pET28aP

5、TDeGFP片段2载体由我室构建［10］；工程菌E.ColiDH5α，Rosetta和Jurkat为本实验组保存。纯化树脂ProfinityNi2+IMAC金属螯合填料（美国BioRad公司），蛋白标准参照购自Fermentas公司，鼠抗6×HisTag单克隆抗体(CellSignaling公司)，HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗(北京中杉金桥公司)，ECLplus显色试剂盒、PD10脱盐预装柱(美国GE公司)，异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTGDioxaneFree）（Merck公司，德国），小牛血清（杭州四季青公司），Bradford蛋白定量试剂盒为北京普利

6、莱公司产品，PRMI1640培养基（Invitrogen公司），24孔细胞培养板和细胞冻存管等购自Costa公司，RPMI1640细胞培养基购自Hyclone公司。　　1.2仪器　　尼康(Nikon)全光谱共聚焦显微镜C1Si，流式细胞仪FACSCaliber（美国BD公司）。　　1.3方法　　1.3.13种融合蛋白的诱导表达及纯化。　　将我室构建的pET28aPTDeGFP载体［10］上分别插入目的基因及其片段，测序正确的质粒pET28aPTDeGFP目的基因，pET28aPTDeGFP片段1，pET28aPTDeGFP片段2分别转化大肠埃希菌Rosett

7、a，筛选出阳性克隆，平板上挑单个菌落至3mlLB培养基（含50μg/ml卡那霉素3μl），37℃摇床培养过夜后以1∶100稀释后，将菌液接种于200mlLB培养基，37℃增菌培养至D(600nm)=0.4～0.6时加入终浓度为0.2mmol/LIPTG，于30℃诱导8h。4℃12000r/min离心10min，弃上清，1/10体积的预冷PBS重悬细菌，加入100μg/ml的溶菌酶，冰浴，300AC对融合蛋白进行纯化（按BioRad公司操作说明书进行），即在pH8.0环境中用50