原核表达的含ptdegfp不同分子质量融合蛋白穿膜能力的比较

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1、原核表达的含PTDeGFP不同分子质量融合蛋白穿膜能力的比较作者：田雨香许逊蔺昕陈勋宗扬勇招倩倩季宝菊王胜军许化溪邵启祥【摘要】目的：评价HIV1TAT蛋白转导结构域(PTD)携带的不同分子质量融合蛋白的穿细胞膜能力。方法：诱导表达、纯化含PTDeGFP的不同分子质量的融合蛋白，与细胞共育后，通过流式细胞术、激光共聚焦评价融合蛋白穿膜能力。结果：诱导表达、纯化获得3种含PTDeGFP的不同分子质量的融合蛋白。流式细胞术和激光共聚焦方法分析发现3种融合蛋白均具有高效穿膜能力。结论：PTD介导融合蛋白的穿膜能力与分子质量无直接关系。【关键词】蛋白转导结构域；穿膜

2、效率；增强型绿色荧光蛋白；分子质量［Abstract］Objective:TojudgetheefficacyofthefusionproteinincludingproteintransductiondomainofHIVTATbymultibiotechnologyandtoobtainthemoreeffectivecellularuptakeproteinforthefurtherresearchofitsbiofunction.Methods：TheexpressionofthreefusionproteinswereinducedbyIPTGandw

3、erepurifiedfromtheinclusionbodies.Flow11cytometryanalysisandconfocalmicroscopeobservationwereusedtoevaluatetheefficacyofthefusionproteinstotransduceintotheJurkatcells,whenthecellswereexposedtofusionprotein.Results：ThefusionproteinscouldtransduceintoJurkatTcellsefficiently.Conclusion：Al

4、lthethreefusionproteinscouldcrossthecellmembraneandhadnodifference.［Keywords］proteintransductiondomain;theefficacyoftransmembrane;prokaryoticexpression；greenfluorescenceprotein1988年Green和Frankel分别发现HIV1TAT蛋白能够穿过细胞膜［1,2］，随后的研究发现，TAT蛋白中的47～57(YGRKKRRQRRR)位氨基酸才是真正具有转导作用的区域，被称为蛋白转导结构域(pr

5、oteintransductiondomain，PTD)［3］。该区域能转导自身及与其融合的多肽、蛋白及DNA分子进入几乎所有组织和细胞，甚至血脑脊液屏障，转导效率高且对细胞无明显的损伤［4-6］。PTD的发现，在研究蛋白功能和治疗方面有重要作用。绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)相对分子质量为27ku，在39511nm波长光的激发下可以发射出明亮的绿色荧光［7］，它的表达没有种属特异性，而且产生的荧光不需要辅助因子、底物或其他基因表达产物的协助，灵敏度高。GFP在活细胞、组织或器官中无需任何处理即可在荧光显微镜下直接观察，加之

6、动物体内不产生内源性GFP，因此成为活细胞理想的标记物［8］。增强型绿色荧光蛋白(eGFP)是GFP的突变体，在480nm波长的激发光下可以发射出比GFP亮35倍的绿色荧光［9］，作为报告蛋白，已经广泛应用于基础实验研究。我们利用本实验室现有的PTDeGFP载体，构建同一个目的蛋白的全长和其不同结构域（即片段1和片段2）的表达质粒，在大肠埃希菌中表达，得到3种纯化的蛋白，研究PTDeGFP携带的3种不同分子质量融合蛋白的穿膜效率和能力。1材料和方法1.1材料pET28aPTDeGFP目的蛋白，pET28aPTDeGFP片段1，pET28aPTDe

7、GFP片段2载体由我室构建［10］；工程菌E.ColiDH5α，Rosetta和Jurkat为本实验组保存。纯化树脂ProfinityNi2+IMAC金属螯合填料（美国BioRad公司），蛋白标准参照购自Fermentas公司，鼠抗6×HisTag单克隆抗体(CellSignaling公司)，HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗(北京中杉金桥公司)，ECLplus显色试剂盒、PD10脱盐预装柱(美国GE公司)，异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTGDioxane11Free）（Merck公司，德国），小牛血清（杭州四季青公司），Bradford蛋白定量试